重组DNA技术和基因工程Recombinant DNA technology and Genetic Engineering 三峡大学医学院 盛 德 乔 shengdq@ctgu.edu.cn QQ:834309103

本章主要内容： 重组DNA技术的基本概念 重组DNA技术的基本步骤 重组DNA技术的应用（基因工程药物）

第一节 重组DNA技术的 基本概念

重组DNA技术——是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子（重组DNA分子），并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子或者表达其蛋白产物的过程。也称为基因克隆（gene cloning）或分子克隆（molecular cloning） 。

克隆(clone）——指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 克隆——指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。

几个相关名词： 基因克隆 分子克隆 重组DNA 基因工程 上游技术（重组DNA技术） 下游技术—规模化培养细胞，分离纯化产物

目的： 获得某一感兴趣的基因或DNA 的大量拷贝 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）—基因工程药物

Brief Introduction

第二节 重组DNA技术的基本步骤

重组的DNA 重组的DNA在宿主细胞中复制 分离、测序、纯化DNA片段 载体 DNA片段

基本流程 分离得到一个感兴趣的基因（靶基因），挑选合适载体（如何挑？）； 将靶基因插入合适的载体，构成一个重组体（复制子）；（如何插入？） 重组体就是重组DNA 重组体导入合适的宿主细胞，靶基因可以复制大量拷贝甚至表达。 （如何导入？/如何证实？）

基本过程 分—分离靶基因和载体 切—酶切目的基因和载体 接—拼接重组体 转—转入受体细胞 筛—筛选重组体

一、分离靶基因和载体 载体（一般商业化购买或赠送） 目的基因： 基因组DNA 人工合成 PCR RT-PCR

The Nobel Prize in Chemistry 1993 PCR技术简介 Polymerase chain reaction (PCR) 是由 K. Mullis 于1985发明的, 这项技术通过模拟DNA的复制过程，在体外大量扩增目的DNA片段。 PCR 技术使我们可以无限制地扩增我们研究的DNA 片段，特别是哪些不容易得到的目的DNA片段。 Kary B. Mullis The Nobel Prize in Chemistry 1993

PCR基本原理 三步曲: 变性、退火、延伸 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

PCR的基本反应步骤 变性 95˚C 退火 Tm-5˚C 延伸 72˚C

PCR反应体系： DNA模板 一对引物 耐热DNA聚合酶（Taq） dNTPs Mg2+

RT-PCR mRNA为模板 产物为cDNA（gDNA） 优点？

载体（vector） 定义 常用载体 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 质粒载体 噬菌体载体 病毒载体（逆转录病毒载体！） 人工染色体

载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。

按用途分： 克隆载体(cloning vector)——为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) ——为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。

质粒 (plasmid) ——是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。 特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。

质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。

质粒载体pBR322 复制起始点 选择标志 单一的酶切位点

二、酶切 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) —是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 必备工具 Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG + GATCC G

限制性核酸内切酶的分类和命名 回文序列

+ + 平端切口 粘端切口 GTCGAC CAGCTG GGATCC CCTAGG GTC CAG GAC CTG GATCC G G Hind Ⅱ Bam HⅠ GTCGAC CAGCTG GGATCC CCTAGG GTC CAG GAC CTG GATCC G + + G CCTAG 左下角处有超级链接到配伍末端 平端切口 粘端切口

限制性内切核酸酶

三、连接 DNA连接酶——催化生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。 T4 DNA连接酶(来自噬菌体)

具有互补的粘性末端方可连接

重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3´末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基

四、重组体转入受体细胞 实验室常用的基因工程菌： 感受态细胞——即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。 遗传背景清楚！ HB101、JM109、DH5a 感受态细胞——即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。 42℃休克处理可提高转化效率

导入方式： 转化 (transformation)：脂质体 转染 (transfection)：病毒颗粒 转导 (transduction)：噬菌体

实验室常用方法：脂质体转染

五、重组体的筛选和鉴定 利用宿主细胞遗传表型的改变来筛选 分析重组子分子结构特性进行鉴定 抗药性标志筛选 插入失活 β－半乳糖苷酶系统筛选 内切酶图谱鉴定 Southern 印迹杂交 菌落原位杂交 PCR鉴定 测序

插入失活筛选阳性克隆 插入失活 Ampr Tetr Amps Tetr

抗药性标记选择 (插入失活法) 插入失活 选择标记易丢失，要随时保持选择压力！！

(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) α互补的检测 IPTG (异丙基-β-D-半乳糖苷) X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)

挑选白斑/蓝斑？

A B C M bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 内切酶图谱鉴定

第三节 重组DNA技术的应用

重组DNA技术发展史 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物——重组人胰岛素在英、美获准使用 第一批转基因家畜（兔、猪和羊）， 中国 转基因鱼

Dolly 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程

重组DNA技术的应用 医学方面： 其它方面： 基础研究（疾病相关基因的克隆及功能研究） 基因治疗 基因工程药物（药物、疫苗） 转基因动物 转基因植物（农作物）

生物制药 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。 美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。

重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素( 1b, 2a,  2b, ) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱

亚单位疫苗生产

基因治疗的概念 定义——基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)

1990.9.14 首例基因治疗 4岁 女孩 严重免疫缺陷症(SCID) 缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA) 2--脱氧腺苷含量升高 毒性 1990.9.14 首例基因治疗 4岁 女孩 严重免疫缺陷症(SCID) 缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA) 2--脱氧腺苷含量升高 毒性 严重破坏免疫功能 靶细胞为病人淋巴细胞 ADA基因 LN逆转录病毒载体 回输

转基因植物 “Golden rice” has been genetically modified to contain beta-carotene The luciferase gene from a firefly is transformed into tobacco plant using the Ti plasmid.

转基因食品的安全性？ 转基因食品的危害http://video.sina.com.cn/v/b/92765713-3021178435.html

转基因动物 Transgenic animals Green fluorescence Red fluorescence

基因工程药物

The Hope

Some day……just a joke