第三章 海洋药物研究的关键技术
生物活性bioactivity是指能引起细胞正常机理发生改变的能力 第一节 生物活性筛选技术 一、什么是生物活性筛选技术？ 通过活性评价模型，判断化合物作用的原理和方法相结合的手段 生物活性化合物，是来自生物体内的对生命现象有影响的微量或少量物质。 如：糖类、脂类、多肽类、甾醇类、生物碱、甙类、大环内脂等。
二、为什么利用生物活性筛选技术？ ① 发现生物活性化合物 ② 新药发现的导向和指针 ③ 体现着药学和生命科学的最新研究成果
三、生物活性筛选技术有哪些特点？ ① 体现着生理学、病理学和药理学的研究进展 ② 同一种疾病的治疗药物可以通过多种生物活性筛 选方法进行探索 ③ 生物活性筛选是多层次和多靶点的 如胆固醇的合成及其相关酶
乙酰基（C2）→异戊二烯（C5）→鲨烯（C30）→胆固醇（C27） A. 乙酰CoA合成异戊烯焦磷酸（IPP） 2分子乙酰CoA经硫解酶催化缩合成乙酰乙酰CoA，由HMG- CoA合成酶催化结合1分子乙酰CoA，生成β-羟基-β-甲基戊二酸单酰CoA（HMG- CoA）， HMG- CoA还原酶（限速酶）催化其生成甲羟戊酸（MVA），消耗2分子NADPH。甲羟戊酸经磷酸化、脱羧三步酶促反应生成活泼的异戊烯焦磷酸（IPP）。
B.鲨烯的合成 一种异构酶催化异戊烯焦磷酸转换成二甲烯丙基焦磷酸（DPP）。然后它按照头对尾方式与另一分子异戊烯焦磷酸缩合成10C牻牛儿焦磷酸。再按头对尾方式与另一分子异戊烯焦磷酸缩合成15C焦磷酸法尼酯（FPP），2分子FPP由鲨烯合成酶催化，仍然按头对尾方式缩合成30C的鲨烯。
C.鲨烯转换为胆固醇 鲨烯转换为胆固醇的过程很复杂，一个中间产物是羊毛固醇，涉及加氧、环化，形成由四个环组成的胆固醇核的反应。而由羊毛固醇到胆固醇还要经过甲基的转移、氧化、脱羧等约20步反应。
胆甾-5-烯-3β-醇 胆固醇
环节动物、海胆、海虾、水螅、金鱼、斑马鱼 四、生物活性筛选类型Bioactivity Screening 环节动物、海胆、海虾、水螅、金鱼、斑马鱼 动物水平 细胞水平 分子水平 疾病模型动物 天然或诱导 酶激动剂或抑制剂 受体激动剂或抑制剂 抗原抗体反应 模型 特点 肿瘤细胞 细菌 抗肿瘤、抗血栓、抗糖尿病、抗病毒、抗炎、降血压、降血脂 应用 特点 预测临床疗效和药用前景 肿瘤药物筛选 抗生物质筛选 肿瘤、血栓、动脉硬化。神经系统疾病动物模型、循环系统疾病动物模型、呼吸系统疾病动物模型、消化系统疾病动物模型。 常见人类疾病动物模型的制备方法，北京大学医学出版社 Hela细胞、P388细胞 稻瘟病菌 常见 方法 DNA拓扑异构酶、蛋白激酶、乙酰胆碱酯酶等近800种
五、典型生物活性筛选方法 海绵 1.琼脂板扩散法 ③海洋生物提取物 ②白念珠菌 Monilia albican ①含麦角甾醇 琼脂板 (22E,24R)-麦角甾烷-5,7,22-三烯-3β-醇 ②白念珠菌 Monilia albican ①含麦角甾醇 琼脂板 ①无麦角甾醇 琼脂板 ⑤3种海绵抗真菌不受麦角甾醇影响 3种海绵减弱 ④10种海绵抗真菌
2. 抗肿瘤药物筛选方法 图3-1
它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并从中找到有价值的信息。 六、高通量和高内涵筛选 1.什么是高通量筛选？ 高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技术体系。
FLIPR (fluorometricimagingreadet)荧光检测法 Alpha (Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay) Screen检测法
2. 什么是高内涵筛选技术？ 高内涵筛选（High Content Screening，HCS）是在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。 从技术层面而言，高内涵筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术，旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。
3. 高通量筛选技术和高内涵筛选技术的差别？ 高通量筛选技术 高内涵筛选技术 检测范围 化合物活性 靶点激活、细胞凋亡、分裂指数、蛋白转位、细胞活力、细胞迁移、受体内化、细胞毒性、细胞周期和信号转导等 检测特性 数据平均性 细胞和分子 数据丰富性，立体性，多样性 细胞 检测特性 检测分析仪器 荧光显微系统、荧光图像获取系统、检测分析仪器、图像处理分析软件、接管分析和数据管理系统
第二节 分离纯化技术 海洋天然产物常见的是萜类、烃类、聚酮、聚醚、大环内脂、多肽、生物碱和无法归属的新类型 分离纯化方法不同于陆地植物的分离纯化方法