第十七章 流式细胞仪分析技术及应用

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成 细胞功能 大小 细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 粒度 细胞活性 DNA, RNA含量 胞内细胞因子 蛋白质含量 激素结合位点 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性

一、工作原理 采用激光作为激发光源， 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，

1.流式细胞仪的基本结构： （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统

（1）液流系统 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流

鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。

液流系统示意图 喷嘴 Fluorescence signals Focused laser beam 鞘液

FCM的液流系统（如何形成单个细胞流） 鞘液管 样本管

（2）光学系统 激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）

光学系统示意图 Flow Tip Laser SS and FL Detector FS Detector

（3）数据处理系统 主要由计算机及其软件组成

基本工作原理

基本过程 单细胞液柱 已标记的单细胞悬液和鞘液 硅化管 流动室 喷嘴 荧光检测系统和 散射光感受系统 收集光信号 荧光染料被激发发光 光电倍增管 脉冲信号 计算机系统分析结果 放大 垂直相交 形成稳态 水平激光与之

流式细胞仪与显微镜的区别 区别 流式细胞仪 显微镜 光源 激光 自然光、灯光 对象 细胞、生物粒子 细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室 载玻片 检测信号 光学信号 形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计 计算机，>5000 人工，200 结果 多参数，综合分析 简单，单参数

二、散射光的测定 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。

前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0

前向散射光示意图 FALS Sensor Laser

侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

侧向散射光示意图 FALS Sensor 90LS Sensor Laser

测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 中性粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群

荧光染料的特性 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION)

荧光补偿

四、细胞分选原理 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。

（一）分选基本原理 细胞悬液形成液流柱 流动室振动 液流断裂成液滴 空白液滴 含细胞的液滴 弃去 偏转落入收集器 压电晶体 不充电 充电 产生机械振动 不充电 充电

第二节 数据的显示与分析 参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术

一、 参数 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少

二、数据显示方式 直分析方图 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 设门分析:REGION和GATE设置

（一）单参数直方图 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。

细胞相对数量 信道(channel ) 单参数直方图

1.双参数直方图点图 绿色荧光强度 红色荧光强度

双参数直方图点图

（四）流式细胞仪的多参数分析 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。

三、设门分析技术 Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。

A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均为任意门

线性门

Region设置: 区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。

如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。 D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+

第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制

一、免疫检测样品制备 单细胞悬液 外周血淋巴细胞样品的制备 培养细胞的样品制备 分离单个核细胞 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤

新鲜实体组织单细胞悬液的制备 单细胞悬液的保存 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）

二、常用的荧光染料与标记染色 适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性

（一）几种常见的荧光染料 FL1 FL2 FL3 FL4 激光 细胞悬液 FITC 异硫氰酸荧光素 Texas red 得州红 PE.PC.APC PEcy5 FL1 FL2 FL3 FL4 异硫氰酸荧光素 激光 得州红 藻胆蛋白类 能量传递复合染料

常用的几类荧光染料 名称 染料 激发波长 荧光颜色 溶解性 对PH敏感性 特点 异硫氰酸荧光素 FITC 488 绿 525 易 敏感 易溶于水，与抗体结合不影响特异性 得州红 Texas red 568 红 615 不易 不敏感 稳定，偶联后量子产额低 藻红蛋白 PE 橙 575 具较多发光基团，消光系数和量子产额高 藻青蛋白 PC 别藻青蛋白 APC 633 670 能量传递复合染料 PEcy5 减少交叉，成本高

能量传递复合染料 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。

能量传递复合染料机制 575nm PE CY5 488nm 670nm 红色荧光 藻红蛋白 花青苷5

第四节 在免疫学检验中的应用

一、淋巴细胞及其亚群的分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+)

二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统及白血病免疫分型 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定 三、淋巴造血系统及白血病免疫分型 对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变

四、肿瘤耐药基因分析 五、AIDS病检测中的应用 MDR(+)表示对化疗药物耐药 五、AIDS病检测中的应用 CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例

六、自身免疫病相关HLA抗原分析 HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As) 患者

七、移植免疫中的应用 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。