（Molecular Luminescence Analysis） 第6章 分子发光分析 （Molecular Luminescence Analysis） 6.1 分子荧光及磷光分析 一、基本原理 二、荧光仪器 三、磷光分析 6.2 化学发光分析 一、概述 二、基本原理 三、化学发光的类型 四、化学发光测定仪器 6.3 生物发光简介

分子能级=电子能级(Ee)+振动能级(Ev)+转动能级(Er)。 6.1 分子荧光分析及磷光分析 一、基本原理 分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光 能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回 至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析 包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。 物质分子吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。 1. 分子能级、荧光及磷光的产生 分子能级=电子能级(Ee)+振动能级(Ev)+转动能级(Er)。 其中电子能级包含振-转能级，如图。

三重态能级低于单重态（Hund规则） 激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单 重态，以S1，S2…表示 激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。 基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。

2. 去活化过程（Deactivation） 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态 。这些过程包括： 1）振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR） 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将剩余的振动能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 2）内转换（Internal Conversion，IC） 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级。如S2-S1；T2-T1。

4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC） 3）荧光发射 分子电子从单重激发态（Kasha规则）的最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为荧光。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长（Stokes效应）。 4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC） 系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。

5）磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-4-10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。 6）外转换（External Conversion，EC） 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。

3. 定性分析 1）激发光谱 荧光和磷光均属于光致发光。任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱－－荧（磷）光定性分析的基础。 通过测量荧光(或磷光)体的发光强度随激发光波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。 具体测绘方法：通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光照射激发荧光(磷光)体，发出的荧光(磷光)通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，检测其荧光(磷光)强度，最后通过记录仪记录光强度对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。通过激发光谱，选择最佳激发波长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用λex表示。

2）发射光谱 ，也称荧光光谱或磷光光谱 通过测量荧光(或磷光)体的发光强度随发射光波长的变化而获得的光谱，称为发射光谱。其测绘方法，是固定激发光的波长，扫描发射光的波长，记录发射光强度对发射光波长的关系曲线，即为发射光谱。通过发射光谱选择最佳的发射波长——发射荧光(磷光)强度最大的发射波长，常用λem表示，磷光发射波长 比荧光来得长，右图为萘的激发光谱及荧光和磷光的发射光谱。

3）激发光谱与发射光谱的特征 i）斯托克斯位移 与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓Stokes位移。（振动弛豫失活所致） ii）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 尽管分子受激可到达不同能级的激发态，但由于去活化（内转换和振动弛豫）到达第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。 换句话说，不管激发波长如何，电子都是从电子第一激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。

iii）荧光激发光谱的形状与发射波长无关 由于在稀溶液中，荧光发射的效率(称为量子产率)与激发光的波长无关，因此用不同发射波长绘制激发光谱时，激发光谱的形状不变，只是发射强度不同而已。 iV）镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系（如下图）。

荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。 解释1：能层结构相似性 荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。 吸收光谱是由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能层而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。 由于激发态和基态的振动能层分布具有相似性，因而呈镜像对称。 S1 S0

解释2：位能曲线（Frank-Condon原理）。 由于电子吸收跃迁速率极快（10-15s），此时核的相对位置可视为不变（核较重）。当两个能层间吸收跃迁的几率越大，其相反跃迁的几率也越大，即产生的光谱呈镜像对称

4. 影响荧光及荧光强度的因素 产生并可观察到荧光的条件： i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）； ii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光。 即量子效率  足够大： kF荧光发射过程的速率常数，∑ki为其它有关过程的速率常数的总合。可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常， kF 由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境（外因）和结构共同决定。

2）共轭效应：共轭度越大，荧光物质的摩尔吸收系数越大，荧光越强。 下面讨论影响荧光及强度的因素。 1）跃迁类型：通常，具有—*及n—*跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具—*跃迁的量子效率比n—*跃迁的要大得 多（前者大、寿命短）。 2）共轭效应：共轭度越大，荧光物质的摩尔吸收系数越大，荧光越强。 3）刚性结构：分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。如 荧光素（=0.92）,酚酞（=0） 芴（=1） 联苯（ =0.18）

4）取代基：  给电子取代基增强荧光(p-共轭)，如-OH、-OR、-NH2、 -CN、NR2等；  吸电子基降低荧光，如 -COOH、-C=O、 -NO2、-NO、-X等；  重原子降低荧光但增强磷光，如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失。该现象也称重原子效应。这是因为原子序数高的原子中，电子自旋和轨道运动之间的相互作用大，增大了系间窜跃速度

5）溶剂效应  溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变—*及n—* 跃迁的能量）；  与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。 6）温度 温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。

7）pH值：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。 8）内滤光和自吸：体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射，称为荧光自吸。 9）荧光猝灭：荧光物质与溶剂分子或其他物质的分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂或猝灭剂。荧光猝灭的原因多，机理复杂。这里只讨论几种类型：

①碰撞猝灭:主要原因是，当处在单重激发态上的荧光分子M ①碰撞猝灭:主要原因是，当处在单重激发态上的荧光分子M*与熄灭剂Q发生碰撞，使激发态分子以无辐射的跃迁方式回到基态，产生荧光熄灭作用。这个过程可用下列反应式表示。 显然，荧光熄灭程度主要取决于相应反应的速率常数的相对大小和熄灭剂Q的浓度。

②静态猝灭: 荧光分子与猝灭剂形成不发荧光的基态配合物从而使荧光猝灭。氧是最典型的荧光猝灭剂，可能是顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光分子相互作用，加速荧光物质激发态分子的系间窜跃导致荧光猝灭。 ③能量转移：熄灭剂与激发单重态的荧光分子作用后，发生能量转移，使熄灭剂Q得到激发。 ④自熄灭和自吸收：自熄灭指溶液浓度较大时，激发态分子之间的碰撞引起能量损失，使荧光强度降低；自吸收是指，当荧光物质的吸收光谱与荧光光谱重叠时荧光被溶液中处于基态的荧光分子吸收，导致荧光强度降低。

5. 定量分析 荧光强度IF正比于该体系吸收的激发光的光强。 I0是入射光的强度；I是入射光通过厚度为b的介质后的光强；常数K’取决于荧光效率。根据比耳定律 代入上式，得

展开上式，得 上式可近似为， 若恒定，有 上式表明荧光强度与荧光物质的浓度成正比。不过这种线性关系只在稀溶液中才成立。

二、荧光仪器 第一单色器 或滤光片 记录仪 第二单色器 荧光 光源 激发 样品池 1）光源：要求具有强度大，适用波长范围宽等特点，常用的有高压汞灯和氙灯。前者使用的谱线365nm，405nm，436nm；后者是连续光源，可用于200-700nm波长范围，此范围内光强几乎相同。此外还有激光；

2）样品池：石英（低荧光材料）； 3）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器；前者用于选择所需要的激发光的波长 ；后者消除溶液中可能存在的其它光线的干扰，以获得所需要的荧光 。 4）检测器：光电倍增管。

荧光分析的特点： ①灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001g/mL之间。可 见，比UV-Vis的灵敏度高得多！ ②选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 ③结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量 子效率、荧光寿命等。 ④应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。

三、磷光分析 1. 磷光的特点：  磷光波长比荧光的长(T1<S1)；  磷光寿命比荧光的长(磷光为禁阻跃迁产生，速率常数小)；  磷光寿命和强度对重原子和氧敏感(自旋轨道耦合，使去活化速率常数增加)。 2. 低温磷光（液氮） 由于磷光寿命长，T1的非辐射跃迁（内转换）几率增加，碰撞失活（振动弛豫）的几率、光化学反应几率都增加，从而降低磷光强度。因此有必要在低温下测量磷光。 同时要求溶剂：易提纯且在分析波长区无强吸收和发射；低温下形成具有足够粘度的透明的刚性玻璃体。 常用的溶剂：  EPA——乙醇+异戊烷+二乙醚（2+2+5）  IEPA——CH3I+EPA（1+10）。

3. 室温磷光 低温磷光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，1974年后发展了室温磷光（RTP）。 1）固体基质：在室温下以固体基质（如纤维素等）为吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具有多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。 利用胶束增稳、重原子效应和溶液除氧是该法的三要素。 3）敏化磷光：其过程可以简单表示为：

在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片。如右图所示。 4. 磷光仪器 在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片。如右图所示。 斩光片的作用是利用其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射。 转筒式 转盘式

6.2 化学发光分析 一、概述 1.化学发光:利用化学反应所释放的化学能激发了体系中某种 化学物质分子,当受激分子跃迁回到基态时而产生的光发射. 直接化学发光：A+B→C*+D； C*→C+hν （被测物A的产物被激发发光） 间接化学发光：A+B→C*+D；C*+F→F*+E；F*→F+hν （待测物的产物作为激发中间体将能量传给受体F，F*发光。 2.化学发光分析法: 利用化学发光测定体系中化学物质浓 度的方法

3. 特点： 二、化学发光分析原理 （1）灵敏度极高。例如，用荧光素酶和三磷酸腺苷（ATP）的化学 反应可测定低至2×10-17moL·L-1的ATP。 （2）测定线性范围宽，一般有5-6个数量级。 （3）仪器设备简单，不存在杂散光、散射光等引起背景的干扰。 （4）分析速度快。流动注射化学发光法每小时可测定100个以上的 试样 二、化学发光分析原理 1 化学发光两个关键步骤 化学激发 发光

2 化学发光反应必须具备的条件 （1）提供足够的能量激发某种分子。多数发光反应为氧化－还 原反应. （2）反应途径有利于激发态产物的形成 （3）激发态分子能够以光辐射跃迁的方式返回基态，或能够将 其能量转移给可以产生光辐射跃迁的其他分子。 3 化学发光效率和发光强度 化学发光效率Cl定义为：

化学发光强度用单位时间内发射的光子数表示，与反应速 率的关系为 由于被分析物的浓度比发光试剂的浓度小得多，发光反应 一般视为一级反应，用发光总强度进行定量分析。 因此，根据已知时间内的化学发光总强度进行定量分析。 三、化学发光类型 1 气相化学发光 化学发光反应在气相中进行。

（1）氮氧化物的化学发光 NO检测灵敏度1ng·mL-1 （2）利用氧原子的化学发光 2 液相化学发光 化学发光反应在液相中进行。 例如，鲁米诺在碱性溶液中可被H2O2、I2等氧化，可发射最 大吸收波长为425nm光辐射。反应如下：

可检测至10-9 mol·L-1 该反应可以被痕量过渡金属离子所催化，利用这一现象可测 定许多金属离子。还可以测定氨基酸。

6.3 生物发光简介 涉及到酶和生物反应的一类化学发光。如萤火虫反应： L：萤火虫荧光素；E：萤火虫荧光素酶；PPI代谢产生的无机 焦磷酸；对10μgATP样品，检出限10-14 μg。