实验五 致病性球菌的鉴定

实验目的要求 1、掌握常见病原球菌的主要生物学性状 2、熟悉常见病原性球菌有关的鉴定方法

实验主要内容： 一、病原性球菌 葡萄球菌 链球菌 肺炎球菌 脑膜炎球菌 淋球菌

一、葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 白色葡萄球菌 柠檬色葡萄球菌

实验内容 1.形态与培养特性 2.血浆凝固酶实验 3.耐热核酸酶实验（示教） 4.甘露醇发酵试验 5.葡萄球菌肠毒素的测定（示教）

葡萄球菌检验程序 1. 浓汁等标本 直接涂片染色镜检 初报 2. 血液 增菌培养 分离培养，取可疑菌落鉴定 1. 浓汁等标本 直接涂片染色镜检 初报 2. 血液 增菌培养 分离培养，取可疑菌落鉴定 3. 粪便、呕吐物 分离培养（高盐甘露醇平板） 纯培养，煮沸杀菌离心 鉴定肠毒素（ELISA） 4. 细菌鉴定项目 涂片镜检 、 血浆凝固酶实验、耐热核酸酶实验 、甘露醇发酵 5 药敏试验

致病性葡萄球菌鉴定依据 1 金黄色色素 2 有溶血环 3 凝固酶实验阳性 4 耐热核酸酶实验阳性 5 分解甘露醇

三种葡萄球菌的比较 性状 金葡菌 表葡菌 腐葡菌 色素 金黄色 白色 白或柠 血浆凝固酶 + - - 溶血素 + -/+ - 性状 金葡菌 表葡菌 腐葡菌 色素 金黄色 白色 白或柠 血浆凝固酶 + - - 溶血素 + -/+ - 耐热核酸酶 + - - A蛋白 + - - 分解甘露醇 + - - 致病性 强 弱 弱

[方法] 1、分离培养、观察菌落特征：分别取三种葡萄球菌培养物，用分离划线方法接种血平板，37℃培养18-24h以后观察结果（记录结果）。 2、革兰染色、观察形态学特征：取葡萄球菌培养物少许涂片，革兰染色、镜检（画图）。 3、生化反应（示教）：分别取三种葡萄球菌培养物，用穿刺接种的方法接种甘露醇生化反应管， 37℃培养18-24h以后观察结果（示教）。

[结果] 1、血平板生长现象观察 2、形态学观察 3、生化反应结果观察 甘露醇试验

血浆凝固酶实验 1.实验原理 血浆凝固酶是金黄色葡萄球菌的致病物质，有二种：游离型和结合型；前者可使血浆中纤维蛋白原变为纤维蛋白导致血浆凝固；后者使纤维蛋白原变为纤维蛋白，使葡萄球菌凝聚成颗粒。 2. 实验材料 菌种:金葡菌，表皮葡萄球菌 兔或人血浆 生理盐水 玻片 接种环

3. 实验方法与结果 玻片法 生理盐水 血浆 注意事项：玻片扔入废弃缸 将玻片分二格，滴加血浆 分别挑取金葡菌、表皮葡萄球菌于2格内，混匀。 生理盐水 血浆 注意事项：玻片扔入废弃缸 将玻片分二格，滴加血浆 分别挑取金葡菌、表皮葡萄球菌于2格内，混匀。 结果观察

试管法 1. 取二只小试管，各加0.1ml的新鲜兔或人血浆（加抗凝剂） 2. 分别加0.1ml的金葡菌及表皮葡萄球菌肉汤培养物。 3. 37℃孵育1-2小时，每半小时观察一次。 4. 结果判断：试管内血浆呈胶冻状为阳性。

耐热核酸酶实验 1. 实验原理 致病性葡萄球菌产生，耐受煮沸，能分解DNA，使含甲苯胺蓝核酸琼脂显示粉红色。 2. 方法

二 链球菌 甲型溶血性链球菌 乙型溶血性链球菌 丙型链球菌

实验内容 1. 形态与培养（记录结果） 2. 鉴定试验(示教) 3. 抗链“O”测定（记录结果）

1.形态与染色： G+，链状排列，无鞭毛、芽胞。

培养特性 甲型溶血性链球菌 乙型溶血性链球菌 丙型链球菌

鉴定试验（示教） 1.杆菌肽实验（A群链球菌） 2. 奥普托欣敏感试验（A群链球菌） 3. 胆汁溶菌与菊糖发酵试验（与肺炎球菌鉴别） 4. 血清学分群鉴定试验（玻片凝集）

抗链“O”测定 1. 实验原理 机体针对链球菌溶血素O可产生相应抗体（ASO），ASO高滴度的病人血清 (抗体)倍比稀释后与ASO胶乳试剂反应，出现清晰均匀的乳胶颗粒，当抗体滴度大于诊断标准时，即可辅助诊断风湿热。 2. 实验材料 ASO快速凝集胶乳试剂盒 病人血清 玻片

3. 实验方法 1）加血清1滴 2) 加ASO胶乳试剂1滴，摇动2min 3)结果 出现清晰凝集颗粒为阳性 注意事项：玻片扔入废弃缸

肺炎球菌 脑膜炎球菌 淋球菌

肺炎球菌 脑膜炎球菌 淋球菌 实验内容 肺炎球菌 脑膜炎球菌 淋球菌标本片观察 实验结果：画图

肺炎链球菌 俗称肺炎球菌。在自然界广泛分布，常寄居于正常人的鼻咽腔中，多数不致病或致病力弱，仅少数有致病力，是细菌性大叶肺炎、脑膜炎、支气管炎的主要病原菌。

形态与染色 革兰阳性双球菌 直径1μm。矛头状，钝端相对 厚荚膜 + 鞭毛 - 芽胞 - 自溶酶 + autolysin

培养及生化反应 培养特性 需氧或兼性厌氧 营养要求高 在固体培养基上形成 “脐状”菌落 a溶血环 生化反应 可发酵菊糖，可被胆汁溶解，鉴别肺炎球菌与甲型溶血性链球菌

脑膜炎球菌形态与染色 G- ，0.6-0.8µm 肾形或豆形，成双排列，凹面相对； 病人脑脊液（CSF）中典型，多位于中性粒细胞内； 无鞭毛和芽胞；新分离株具有荚膜和菌毛

培养特性与生化反应 培养特性 生化反应 专性需氧。营养要求高。最常用的培养基是巧克力色培养基 可产生自溶酶，人工培养时若不及时移种，数日后菌体自溶

微生物学检查法 标本 脑脊液、血液、出血点渗出液、鼻咽拭 保暖、保湿、立即送检，培养基预温 直接涂片镜检 分离培养与鉴定 脑脊液、血液、出血点渗出液、鼻咽拭 保暖、保湿、立即送检，培养基预温 直接涂片镜检 中性粒细胞内、外有革兰阴性双球菌，可作出初步诊断。 巧克力（色）培养基 快速诊断 对流免疫电泳，SPA协同凝集试验

淋球菌形态与染色 革兰染色阴性，0.6-0.8μm 成双排列，似一对咖啡豆 有菌毛，无芽胞和鞭毛，新分离株有荚膜

培养特性 生化反应 培养特性 需氧，营养要求高。常用的培养基为巧克力色血液琼脂平板 生化反应 除葡萄糖外，不分解其它糖类