分子发光分析法 molecular luminescence analysis 第一节 分子荧光与磷光

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分子发光分析法 molecular luminescence analysis 第一节 分子荧光与磷光 一、分子荧光与磷光产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 二、激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 三、荧光的产生与分子结构关系 relation between fluorescence and molecular structure 四、影响荧光强度的因素 factor influenced fluorescence 分子发光分析法 molecular luminescence analysis 第一节 分子荧光与磷光 molecular fluorescence and phosphorescence 2017/3/11

一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分子结构理论,主要讨论荧光及磷光的产生机理。 1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂; 在每个电子能级上,都存在振动、转动能级; 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级):吸收特定频率的辐射;量子化;跃迁一次到位; 激发态→基态:多种途径和方式(见能级图);速度最快、激发态寿命最短的途径占优势; 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ; 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ; 2017/3/11

2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度:M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1); 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则),三重态能级比相应单重态能级低; 大多数有机分子的基态处于单重态; S0→T1 禁阻跃迁; 通过其他途径进入 (见能级图);进入的几率小; 2017/3/11

2.激发态→基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态,返回基态时,通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量; 传递途径 辐射跃迁 荧光 振动弛预 无辐射跃迁 延迟荧光 磷光 系间跨越 内转移 外转移 激发态停留时间短、返回速度快的途径,发生的几率大,发光强度相对大; 荧光:10-7~10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态; 磷光:10-4~10s;第一激发三重态的最低振动能级→基态; 2017/3/11

S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 磷 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l 2 T2 2017/3/11

非辐射能量传递过程 振动弛豫:同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换:同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫,高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。 外转换:激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁; 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越:不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋,禁阻跃迁,通过自旋—轨道耦合进行。 2017/3/11

辐射能量传递过程 荧光发射:电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态( 多为 S1→ S0跃迁),发射波长为  ‘2的荧光; 10-7~10 -9 s 。 由图可见,发射荧光的能量比分子吸收的能量小,波长长;  ‘2 >  2 >  1 ; 磷光发射:电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态( T1 → S0跃迁); 电子由S0进入T1的可能过程:( S0 → T1禁阻跃迁) S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢: 10-4~100 s 。 光照停止后,可持续一段时间。 2017/3/11

二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 荧光(磷光):光致发光,照射光波长如何选择? 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 (图中曲线I ) 。 激发光谱曲线的最高处,处于激发态的分子最多,荧光强度最大; 2017/3/11

2.荧光光谱(或磷光光谱) 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。 2017/3/11

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3.激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长,振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能量(如能级图 2 , 1),产生不同吸收带,但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态,产生波长一定的荧光(如 ‘2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱(与激发光谱形状一样)成镜像对称关系。 2017/3/11

镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似; 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大,相反跃迁也然。 2017/3/11

荧光激发光谱 荧光发射光谱 200 250 300 350 400 450 500 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱 2017/3/11

三、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure 1.分子产生荧光必须具备的条件 (1)具有合适的结构; (2)具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率(): 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关,如外转换过程速度快,不出现荧光发射; 2017/3/11

2.化合物的结构与荧光 (1)跃迁类型:* → 的荧光效率高,系间跨越过程的速率常数小,有利于荧光的产生; (2)共轭效应:提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 (3)刚性平面结构:可降低分子振动,减少与溶剂的相互作用,故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构,荧光素有很强的荧光,酚酞却没有。 (4)取代基效应:芳环上有供电基,使荧光增强。 2017/3/11

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四、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure 影响荧光强度的外部因素 1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外,溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化; 2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感,温度增加,外转换去活的几率增加。 3. 溶液pH 对酸碱化合物,溶液pH的影响较大,需要严格控制; 2017/3/11

内滤光作用:溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光,如色胺酸中的重铬酸钾; 4.内滤光作用和自吸现象 内滤光作用:溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光,如色胺酸中的重铬酸钾; 自吸现象:化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠,产生自吸收;如蒽化合物。 2017/3/11

5.溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭; 氧的熄灭作用等。 2017/3/11

分子发光分析法 第二节 分子荧光与磷光分析法 一、 仪器与结构流程 instrument and general process 二、 荧光分析法和应用 fluorescence analysis and application 三、 磷光分析法的应用 phosphorescence analysis and application molecular luminescence analysis 第二节 分子荧光与磷光分析法 molecular fluorescence and phosphorescence analysis 08:28:58

一、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成:激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点:有两个单色器,光源与检测器通常成直角。 基本流程如图: 单色器:选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器; 光源:灯和高压汞灯,染料激光器(可见与紫外区) 检测器:光电倍增管。 08:28:58

仪 器 光 路 图 08:28:58

仪器框图 该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析; 08:28:58

同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系,同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种; 同步扫描技术可简化光谱,谱带变窄,减少光谱重叠,提高分辨率; 如图。 合适的可减少光谱重叠; 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似,发射光谱严重重叠,但<15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱; >60nm时,只显示色氨酸的特征光谱,实现分别测定。 08:28:58

可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图 08:28:58

磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法: (1)通常借助于荧光和磷光寿命的差别,采用磷光镜的装置将荧光隔开。 (2)采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。 室温测量时,不需要杜瓦瓶。 08:28:58

二、荧光分析方法与应用 1. 特点 (1)灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2~4个数量级;为什么? 检测下限:0.1~0.1g/cm-3 相对灵敏度:0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 (2)选择性强 既可依据特征发射光谱,又可根据特征吸收光谱; (3)试样量少 缺点:应用范围小。 08:28:58

2.定量依据与方法 (1)定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 : If =  Ia 由朗-比耳定律: Ia = I0(1-10- l c ) If =  I0(1-10- l c ) =  I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时,将括号项近似处理后: If = 2.3  I0  l c = Kc 08:28:58

(2)定量方法 标准曲线法: 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度,绘制标准曲线,再在相同条件下测量未知试样的荧光强度,在标准曲线上求出浓度; 比较法: 在线性范围内,测定标样和试样的荧光强度,比较; 08:28:58

3.荧光分析法的应用 (1)无机化合物的分析 (2)生物与有机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量;可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法; 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定; 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定; 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定; 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 (2)生物与有机化合物的分析 见表 08:28:58

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三、磷光分析法的应用 1.稠环芳烃分析 2.农药、生物碱、植物生长激素的分析 3.药物分析和临床分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物(致癌物质);见表 2.农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱,2,4-D等分析 检测限0.01 g/cm-3 3.药物分析和临床分析 见表 08:28:58

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分子发光分析法 molecular luminescence analysis 第三节 化学发光分析法 一、基本原理 principle 二、化学发光分析的特点 characteristics 三 装置与技术 instrument and technology molecular luminescence analysis 第三节 化学发光分析法 chemiluminescence analysis 2017/3/11

一、基本原理 principle 1. 化学发光反应 在化学反应过程中,某些化合物接受能量而被激发,从激发态返回基态时,发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* → D + h (1)能够发光的化合物大多为有机化合物,芳香族化合物; (2)化学发光反应多为氧化还原反应,激发能与反应能相当 E=170~300 kJ/mol;位于可见光区; (3)发光持续时间较长,反应持续进行; 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中,称生物发光(bioluminescence)。 2017/3/11

2.化学发光效率 化学效率: 发光效率: 时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数): dc/dt 分析物参加反应的速率; 2017/3/11

3.化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中,被分析物相对于发光试剂小得多,对于一级动力学反应: dc/dt =Kc; 定性依据: (1)在一定条件下,峰值光强度与被测物浓度成线性; (2)在一定条件下,曲线下面积为发光总强度(S),其与被测物浓度成线性: 2017/3/11

4.化学发光反应的类型 (1)气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应 NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h 发射的光谱范围:600~875nm,灵敏度1ng/cm-3; b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 → O2 + O (1000 C石英管中进行) SO2 + O + O → SO2* + O2 SO2 * → SO2* + h 最大发射波长:200nm;灵敏度1ng/cm-3; 2017/3/11

氧原子与NO的发光反应: 氧原子与CO的发光反应: O3 → O2 + O (1000 C石英管中进行) NO + O → NO2* NO2 * → NO2 + h 发射光谱范围:400~1400nm;灵敏度1ng/cm-3; 氧原子与CO的发光反应: CO + O → CO2* CO2 * → CO2 + h 发射光谱范围:300~500nm;灵敏度1ng/cm-3; 2017/3/11

c. 乙烯与O3的发光反应 乙烯与O3反应,生成激发态乙醛: CH2O* → CH2O + h 最大发射波长:435nm;对O3的特效反应;线性响应范围1 ng/cm-3 ~1g/cm-3; 2017/3/11

(2)火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中,也存在着很强的化学发光反应; a. 一氧化氮 NO + H → HNO* HNO * → HNO + h 发射光谱范围:660~770nm; 最大发射波长:690nm; 在富氢火焰中: NO2 + 2H → NO + H2O 该反应十分迅速; 2017/3/11

b.硫化物 挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧,产生很强的化学发光(蓝色): SO2 + 2H2 → S + 2H2O S + S → 2S2 * S2 * → S2 + h 发射光谱范围:350~460nm; 最大发射波长:394nm; 灵敏度: 0.2 ng/cm-3; 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。 2017/3/11

(3)液相中的化学发光反应 机理研究较多,在分析中应用最多;可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 应用最多的发光试剂:鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼); 化学发光反应效率:0.15~0. 05; 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程: 该发光反应速度慢,某些金属离子可催化反应;利用这一现象可测定这些金属离子。 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程: 2017/3/11

5. 化学与生物发光分析的应用 (1) 该发光反应速度慢,某些金属离子可催化反应;利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 (2) 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2; (3) 间接测定某些生物试样 氨基酸氧化酶 氨基酸 + O2  酮酸 +NH3 + H2O2 葡萄糖氧化酶 葡萄糖 + O2 + H2O  葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ,确定氨基酸、葡萄糖含量。 2017/3/11

草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系,可发出很强的可见光,发光效率高,使用不同的稠环芳烃,发射出不同颜色的光(冷光源)。 2017/3/11

生物发光分析应用 1 在pH 7~8;荧光素酶(E)和Mg2+的存在下,荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应,生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi): pH7 - 8 ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP· LH2 · E +Mg ppi + 2H+ 复合物与氧反应,产生化学发光: AMP· LH2 · E + O2 [氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O [氧化荧光素]*  氧化荧光素 + h 最大发射波长562nm; 2017/3/11

生物发光分析应用 2 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下,在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下,发生发光反应 : NADH + FMA + H+  NAD+ + FMNH2 黄素酶 FMNH2 + RCHO + O2  FMN + RCOOH + H2O + h 最大发射波长495 nm; 2017/3/11

二、特点 characteristics 1. 灵敏度极高 2. 仪器设备简单 3. 发射光强度测量无干扰 4. 线性范围宽 例:荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析,可测定210-17。Mol/L的ATP,即可检测出一个细菌中的ATP含量 2. 仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正; 3. 发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰; 4. 线性范围宽 5. 分析速度快 缺点:可供发光用的试剂少;发光反应效率低(大大低于生物体中的发光);机理研究少。 2017/3/11

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三、装置与技术 instrument and technology 装置流程: 发光反应室 光检测器 信号放大器 显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行: 静态方式:用注射器分别将试剂加入到反应器中混合, 测最大光强度或总发光量;试样量小,重复性差; 流动注射方式:用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器,定时通过测量室,连续发光,测定光强度;试样量大; 2017/3/11