第六部分 质谱基础与应用

什么是MS? MS = Mass Spectrometry 简单的说，质谱就是用来称量一个分子质量的天平（仪器）。但是严格的说来，是测量一个分子离子的质量/电荷比值的仪器。 2 2

质谱的种类 GCMS 液相色谱质谱联用仪 LCMS 液相色谱质谱联用仪 飞行时间质谱仪 磁质谱 二次离子质谱 SIMS Gas Chromatography Mass Spectrometry LCMS 液相色谱质谱联用仪 Liquid Chromatography Mass Spectrometry 飞行时间质谱仪 Time of Flight Mass Spectrometry 磁质谱 Magnetic Sector Mass Spectrometry 二次离子质谱 SIMS Second Ion Mass Spectrometry

GCMS 新生儿先天性代谢失调的普查

LCMS应用实例 瘦肉精是一类动物用药，将瘦肉精添加于饲料中，可以增加动物的瘦肉量、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。在中国，通常所说的“瘦肉精”则是指克伦特罗，它曾经作为药物用于治疗支气管哮喘，后由于其副作用太大而遭禁用。目前，能够实现这种功能的物质是一类叫做β-受体激动剂的药物，例如莱克多巴胺和沙丁胺醇等，同样能起到“瘦肉”作用、却对人体健康危害过大，因而造成安全隐患。它们也因而在全球遭到禁用。我国也已经于2002年明确将其列入《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品物种目录》。对于瘦肉精的检测，我国的SNT 1924－2007方法标准中规定的定量限一律是0.5 μg/kg。日本肯定列表中克伦特罗限量标准较严格，为0.05 μg/kg，因此对于出口到日本的产品中克伦特罗的检测要求更高。本文建立了使用岛津超高效液相色谱串联质谱联用法检测猪肉中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的方法，可以满足食品进出口的要求。 三聚氰胺 克伦特罗

LCMSMS在医药上的用途 - ADMET DMPK 定量分析 血液 尿液 组织等

新药研发流程 药物发现 临床前研究 临床研究 申请/生产 确定研究目标 先导药物发现、 合成、筛选 工艺开发优化 申请注册 质量控制：QA/QC 临床前研究 药理/药效，TK/ ADME/DMPK 临床研究 一期 二期 三期 药物发现的第一步是确定治疗的疾病目标和作用的环节和靶标，是创制新药的出发点，也是以后施行的各种操作的依据。靶标选定以后，要建立生物学模型，以筛选和评价化合物的活性。新药研制的第三步是先导化合物的发现。所谓先导化合物是指通过各种途径和方法得到的具有某种生物活性或药理活性的化合物。如果研究对象是化药，这个过程最重要的部分就是药物合成。先导化合物一般不能直接成为药物。因此有必要对先导化合物进行优化以确定候选药物。先导化合物的优化就是基于相似性原理制备一系列化合物，评价其全面的构效关系已对其物理化学及生物化学性质进行优化。最终获得优良的化合物——候选药物及其合成路线。 临床前研究是指由制药公司进行的实验室和动物研究，以观察化合物针对目标疾病的生物活性，同时对化合物进行安全性评估。CRO企业通常设置 对应的部门：如ADME、DMPK、TK等，以确定诸如药理、药效、毒理等。 研发中新药申请（Investigational New Application, IND）：在临床前试验完成后，公司要向FDA提请一份IND，之后才能开始进行药物的人体试验。 临床研究是指药物的人体内研究。目的是：评定药物安全性和生物活性，确定药物安全性和剂量，评估药物有效性，寻找副作用，验证药物有效性，监控长期使用的不良反应。 临床Ⅰ期：此阶段大概需要1年时间，由20～80例正常健康志愿者参加。这些试验研究了药物的安全性方面，包括安全剂量范围。此阶段的研究同时确定了药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄、以及药物的作用持续时间等项目。 临床Ⅱ期：此阶段需要约100到300名志愿患者参与进行一些控制研究，以评价药物的疗效。这个阶段大约需要2年时间。 临床Ⅲ期：此阶段持续约3年时间，通常需要诊所和医院的1000～300名患者参与。医师通过对病患的监测以确定疗效和不良反应。 新药申请（New Drug Application, NDA）：通过三个阶段的临床试验，公司将分析所有的试验数据。如果数据能够成功证明药物的安全性和有效性，公司将向FDA提出新药申请。新药申请必须包括公司所掌握的一切相关科学信息。典型的新药申请有10万页甚至更多。根据法律，FDA审核一份NDA的时限应该为6个月。但是几乎所有案例中的新药申请从首次提交到最终获得FDA批准的过程都超过了这个时限；在1992年对于新分子实体的新药申请平均审核时间为29.9个月。 批准：一旦FDA批准了一份新药申请，此种新药就可以被医师用于处方。公司必须继续向FDA提交阶段性报告，包括所有的不良反应报告和一些质量控制记录。FDA还可能对一些药物要求做进一步的研究（Ⅳ期），以评价药物的长期疗效。 最后是药物的规模生产，这个过程就是药物的质量控制与生产监控，即使QA/QC研究。 现今，由于FDA的要求愈加严格，药企在提交申请之前，通常会做一项称之为质量研究（Quality Research，QR）的工作。对药物/药品、制型剂、药包材等进行质量控制，比如对杂质光学异构体的研究，对限定量杂质的结构确定等。 以上，可以看出新药研发是个非常复杂的过程，风险也非常大，由此而诞生了CRO/CMO企业。 7 7

新药研发涉及分析仪器 药物发现 临床前研究 临床研究 申请/生产 LC/MS/TOF/2D-LC/Nano-LC LC/GC/MS/Spc/UHPLC/UFLC LC/GC/MS LC/GC/MS/IT-TOF/Spc/Co-Sense LC/GC/MS/Co-Sense/Spc/IT-TOF LC/LCMS/IT-TOF/Prep-LC LC/GC/MS/Spc/TA/SALD Spc指光谱 NMR、UV、IR、AA、ICP、DSC、TGA、XRD、TOC、Particle Sizer… 8 8

Biomarker Discovery and Metabolite Game © 2010 SHIMADZU 9

Concept of MS/MS comparison (1) Parent drug Metabolite A Metabolized This part is not modified. MS/MS Analysis MS/MS Analysis The part that not modified could be observed as common peaks between MS/MS spectra of parent drug and metabolites. Metabolite A MS/MS spectrum m/z Int. Parent Drug MS/MS spectrum 10

Preclinical research Tools TOF MS在蛋白质组学等上的应用 Ｒ＆Ｄ Prediction Diagnosis Therapy Human DNA Life Science Fields Medical Fields Genome Proteome Metabolome Drug Discovery Protein Cell Cellome Gene Diagnosis/ Therapy Preclinical research Tools Analytical Mass Spectrometer 2D/LC SNPs Marker discovery Gene test Medical Dedicated PET scanner NIRS Imaging Integration Clinical diagnosis

肽序列标签 二级质谱用于蛋白鉴定 AXIMA-Performance (MALDI-TOF-TOF) 除了肽指纹图谱的蛋白鉴定方法之外，还有更好的蛋白鉴定方法，就是二级质谱蛋白鉴定方法。蛋白经过酶解，质谱鉴定出多肽，而多肽可以在质谱中被打碎，由碎片的信息可以大概知道多肽的序列情况。 而蛋白数据库中酶解的多肽，也根据质谱的碎裂规律，得到理论的多肽碎裂情况。如果两者相匹配，则仅靠一条多肽的信息，就可以可靠的鉴定出这个多肽所属的蛋白。由于是靠多肽的部分序列鉴定蛋白的，这种技术也叫做肽序列标签技术。 岛津的AXIMA-TOF2就是这样一台可以方便的进行二级质谱进行蛋白鉴定的高端质谱仪。 AXIMA-Performance (MALDI-TOF-TOF)

多肽，核酸等的质量控制（QA/QC）

微生物鉴定系统 AXIMA@SARAMIS™

MALDI MS Imaging Frozen brain tissue is sectioned. Tissue placed on MALDI target plate. Matrix deposited MALDI analysis

DART 美钞上的 Cocaine

质谱仪器的发展 1911年: 世界第一台质谱装置（J.J. Thomson） 40年代: 用于同位素测定和无机元素分析 40年代: 用于同位素测定和无机元素分析 50年代： 开始有机物分析（分析石油） 60年代： 研究GC-MS联用技术 70年代： 计算机引入 80年代： 新的质谱技术出现：快原子轰击电离子源，基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源；LC-MS联用仪，感应耦合等离子体质谱仪，富立叶变换质谱仪等 讲到质谱就不能不提质谱的发展进程。 质谱由于其

分析科学技术 年份 名字 研究 1948 蒂赛利乌斯 电泳 1952 马丁，辛格 色层分析 1964 霍奇金 衍射分析 1991 R.R.Ernst 高分辨核磁共振波谱学 2002 Joh. B. Fen 对生物大分子进行确认和结构分析的质谱方法 Kuthrich 溶液中生物大分子的三维结构的新方法 18 18

为什么要使用MS？ 快速(speed） 高选择性 (Selectivity) 高灵敏度(Sensitivity) SIM 高灵敏度(Sensitivity) ppb/pg 级别或更低 高可靠性 (Stoichiometric) 分子量和结构信息 理想的定性定量工具 快速(speed） 19

质谱？ 样品 离子或离子碎片 离子化 质量分析 质谱图 定性定量分析 20

MS流程图 样品 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 GC进样 LC进样 直接进样 数据处理 真空系统 21 21

为什麽MS需要高真空 提供足够的平均自由程 提供无碰撞的离子轨道 减少离子-分子反应 减少背景干扰 延长灯丝寿命 消除放电 增加灵敏度 22

为什麽MS需要高真空 高真空 + ion air, water etc. 低真空 + 真空系统确保离子由离子源转移至检测器 Taking a look at MS from another side, MS is the vacuum instrument. In low vacuum , There are many neutral particles, such as air and water molecules. Ions collide with these residual neutral particles and ions immediately disappear. On the other hand , in high vacuum , ions can keep flying for a long distance We call the average flying distance of molecules without collision with other molecules “ Mean free path” That is , ions have longer mean free path in high vacuum than in low vacuum. High vacuum is required for ions having long life time. Ions can reach to detector in only high vacuum. + 23 23 23

排气系统 主泵 副泵 压力 10-3-10-4 Pa(平均自由路径 5m-50m) Lens system Detector Ion source Lens system Rod Detector Evacuation system is composed of vacuum chamber containing MS units, main pump evacuating the chamber ,and the” fore pump”. As” fore pump”, the rotary pump is usually used. The evacuating system removes neutral particle from MS and provide an adequate mean free path for ions The vacuum inside chamber is usually 10 -3 to 10-4 Pa. for MS Under this vacuum, ions can fly almost 5 to 50 meter. This distance is enough for ions to reach detectors from ion source. 主泵 副泵

QP 样品分子 通常的离子化方法 + e- 碎片离子 EI 电子轰击电离 灯丝 CI 化学电离 FAB 快原子轰击电离 MALDI 基质辅助激光解吸电离 ESI 电喷雾电离 APCI 大气压化学电离 Laser m + m + m a m + a m a m m a m a + matrix + analyte m + a m 25

气质联用使用的电离技术 电子轰击电离（EI） 正化学电离（CI） 26

电子轰击电离（EI） 灯丝 + + e- QP e- e- e- e- + 样品分子 + 碎片离子 27

e-¯ 电子轰击电离（EI） 热电子（70eV）轰击分子，使其电离 丰富的碎片离子=丰富的结构信息 “指纹” M EI spectrum 俵 e-¯ M m1 m3 m2 EI spectrum 硬酯酸甲酯 M.W. 298 28

化学电离（CI） QP e- 反应气 灯丝 -CH4 CH5+ C2H5+ H+ CH4 -C2H4 [M+1] 样品分子 29

CI 谱图 软电离得到少的破碎 分子量测定 产生“理论”的谱图 高灵敏度(低至pg级水平) 30

e¯ 正化学电离（PCI） M PCI spectrum 硬酯酸甲酯 M.W. 298 首先电离反应气分子—》样品分子主要 由质子转移电离 容易产生准分子离子—》用于确定分子量 + CH4 e¯ M C2H5 MH + C2H4 PCI spectrum 硬酯酸甲酯 M.W. 298 31

EI和 PCI的比较 碎片 分子量 EI 模式 PCI 模式 32 32

负化学电离(NCI) 灯丝 e- e- e- e- 反应气 样品 样品 33

MX MX 负化学电离(NCI) e¯ _ e¯ MX+e¯(0~15eV)-->MX¯ X: 电负性强元素 + + 捕获电子形成负离子 MX+e¯(0~15eV)-->MX¯ e¯ CH4 H + + CH4 CH4 CH3 CH4 CH4 _ e¯ MX MX X: 电负性强元素 34

负化学电离(NCI) NCI 质谱图 六氯苯 M.W. 284

离子化和破碎 API CI EI 软 离子化 硬 无碎片 有碎片 36

液质联用使用的电离技术 电喷雾电离（ESI） 大气压化学电离（APCI） 大气压光子电离 （APPI） 37

电喷雾(Electrospray Ionization ESI) LC与大气压离子化质谱仪的接口技术 电喷雾(Electrospray Ionization ESI) 大气压化学离子化(Atmospheric Pressure Chemical Ionization APCI) + - + - + - 3 ) L i q u i d S a m p l e s 2 ) I o C o Nebulizing gas H i g h V o l t a g e E n o v u f a E l S p v o a n o l or p E Flow rate permitted: 0.001~1 ml/ml Room temperature N2 nebulizing gas: 4.5 L/min v a o t r x e i n o a c l t n t i u o s n i o n 高压放电针 L i q u i d S a m p l e s 加热器 Nebulizing gas Flow rate allowed: 0.05 ~ 2 ml/ml Heater: 400oC N2 nebulizing gas: 2.5 L/min 38

Sample target High voltage MALDI-TOF质谱的原理 MALDI-Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization （基质辅助激光解吸电离） 分析物如核酸或多肽，在MALDI 靶上与基质共结晶激光能量间接传递给离子化的分析物 Sample target High voltage

MALDI-TOF质谱工作原理 MALDI Time-of-Flight (TOF) Analyzer detector high voltage v1 m1 v2 m2 v3 m3 MALDI sample laser drift region m1 m2 m3 MALDI-TOF检测分子量多为单电荷 无需做去卷积化等工作 分子量检测简单直观

傅立叶变换离子回旋共振质谱(FT-MS） 四极杆质谱 离子阱质谱 飞行时间质谱 (TOF) 磁质谱 傅立叶变换离子回旋共振质谱(FT-MS） 41

四极质量分析器 + 离子通过改变四极杆的DC/RF电压而被扫描 42

离子阱 原理与四极杆的非常相似 离子被存储在RF和DC场中 43

飞行时间质量分析器 + 所有离子同时启动 小的离子移动速度快 测量已知距离下的速度(飞行时间) 44

扇形磁场质量分析器 + 离子通过变化的磁场和电场被传输 45

傅立叶变换-离子回旋共振 46

多级质谱技术

串级质谱 Tandem mass spectrometers have… Activation Region S MS1 MS2 D vacuum system Tandem mass spectrometers have… a mass analyzer (MS1) that separates ions by mass and selects ions of a single mass …. mass filter an activation region for fragmenting mass-selected ions … generally by collision-induced dissociation a mass analyzer (MS2) for recording the mass spectrum of the fragments of the selected mass …. mass spectrometer

串级质谱 Mass analyzers (MS): Time-of-flight (TOF) Quadrupole (Q) Quadrupole ion trap (GCQ or LCQ) Linear quadrupole (LTQ) Fourier transform mass spectrometer Orbitrap Tandem mass spectrometers (MS/MS): Triple Quadrupole (QqQ) Quadrupole/time-of-flight (QTOF and QSTAR) Tandem time-of-flight (TOF-TOF or TOF2) LTQ/orbitrap 49 49

串级质谱的各种方式 Tandem-in-space: triple quadrupoles quadrupole/time-of-flight (QTOF/QSTAR) TOF/TOFs Tandem-in-time: Quadrupole ion trap (GCQ/LCQ) Linear ion trap (LTQ) Fourier transform mass spectrometer Both space and time: ion trap/TOF (Qit/TOF) LTQ/FTMS LTQ/orbitrap

离子源的多种选择 离子碎裂机理的选择 Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) Atmospheric Pressure MALDI (APMALDI) Electrospray ionization (ESI) Nanospray 离子碎裂机理的选择 Collision-induced dissociation (CID) Low energy CID: 10-50 eV multiple collisions High energy CID: 1-20 keV single collision Infrared multiphoton dissociation (IRMPD) Electron capture dissociation (ECD) Electron transfer dissociation (ETD)

多级质谱技术比较 Bruno Domon and Ruedi Aebersold, Science, 312, 212 (2006)

岛津质谱仪的发展历史 1988 LAMS-50K 1970 GCMS-9000 岛津质谱史的两个第一， 53 53

全系列质谱产品 MALDI-TOF MS LCMS-2010 GCMS-QP2010 Ultra LC-IT-TOF MS 54

岛津飞行时间质谱系列全方位服务于尖端科学研究 AXIMA-Resonance (MALDI-QIT-TOF) AXIMA-Performance 岛津提供了多种不同功能的高端质谱用于蛋白质组学研究，MALDI离子源的质谱仪包括广泛应的AXIMA-CFRplus, 能够做二级质谱的AXIMA-TOF2, 和能够做多级质谱用于蛋白修饰研究的AXIMA-QIT, 还有电喷雾源的LCMS-IT-TOF用于蛋白修饰和代谢组学研究。所以岛津的高端质谱应用于生命科学的方方面面。不仅如此，我们在还有强大的应用支持团队服务于全球的用户，随时解决用户的各种实际问题。 AXIMA-Confidence AXIMA-Assurance LCMS-IT-TOF (ESI-IT-TOF)

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