第四章 微生物的生长和遗传变异

第一节 微生物的生长及控制 第二节 微生物的遗传变异 第三节 菌种的衰退、复壮和保藏

第一节 微生物的生长及控制 一、几个概念 1.生长、繁殖 生长：微生物细胞的增长。（单细胞、多细胞） 繁殖：微生物个体数目的增加。 群体生长：个体的进一步生长，就引起了群体的生长；群体的生长可以用重量、体积、个体浓度或密度指标来测定。 群体生长＝个体生长+个体繁殖 一般微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有意义，所以通常讲的“生长”是指群体生长。

2.世代时间 （1）概念 （2）影响 两次细胞分裂的时间间隔，称为世代时间。 世代时间受培养环境的影响。 注意与生长繁殖的区别 2.世代时间 （1）概念 两次细胞分裂的时间间隔，称为世代时间。 （2）影响 世代时间受培养环境的影响。 不同的微生物，生长繁殖速度不同，世代时间也有不同。

二、微生物生长的测定 测体积 直接法 称干重 （一）测生长量 间接法 比浊法 生理指标法（测含氮量） 比例计数法 直接法 血球计数法 （二）测繁殖数 液体稀释法 平板菌落计数法

微生物生长： 单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的增加。 个体计数 群体重量测定 群体生理指标测定 微生物生长的测定：

（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定 1.培养平板计数法：广泛用于各种样品的检测 方法：（1）涂布法（菌长在表面） （2）倾注法（菌长在表面和基内） 优点：常用、较准确、可对不同种微生物做活菌计数。 缺点： 时间长、人为误差大，有机械损伤。

一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而 不是直接表示为细胞数。

2.膜过滤培养法 当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。

3.液体法 将待测样品做系列稀释，培养后，根据没生长的最低稀释度和出现生长的最高稀释度，应用“或然率”理论，计算出样品单位体积中细胞的近似值。最高稀释度称为临界级数，从3～5次重复的临界级数求最大概率数(MPN)，就可得到较可靠的结果。

4.显微镜直接计数法 1）常规方法： 取定容稀释的单细胞微生物(细菌)悬液 放置在计数板上，在显微镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出供试样品的细胞数。 缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察

2）其它方法： 比例计数： 过滤计数： 活菌计数： 将已知颗粒浓度的样品与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。 过滤计数： 当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品 通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显 微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数； 活菌计数： 采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数

（二）以生物量为指标测定微生物的生长 1.比浊法 根据在一定的浓度范围内，菌悬液的微生物细胞浓度与液体的光密度成正比，与透光度成反比。菌数越多，透光量越低。可使用光电比色计测定，通过测定菌悬液的光密度或透光率反映细胞的浓度。菌悬液浓度必须在107个/毫升以上。

2.重量法 以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量； 通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算 微生物群体的生物量；

3.生理指标法 微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、 生物热等与其群体的规模成正相关。 常用于对微生物的快速鉴定与检测

三、微生物的群体生长规律 （一）单细胞微生物的典型生长曲线 生长曲线 将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映单细胞微生物在整个培养期间菌数变化规律的曲线。

（一）单细胞微生物的典型生长曲线 根据微生物生长速率常数（每小时的分裂代数）的不同，一条典型的生长曲线至少可以分为： 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期

1.迟缓期 将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。 迟缓期的特点： 细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感。 合成代谢活跃

② 接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。（基数大） 如何知道处于对数期 影响延滞期长短的因素： ① 接种龄 接种龄即“种子” 的群体生长年龄，亦即它处在生长曲线上的哪一个阶段。实验证明，如果以对数期接种龄的“种子”接种，则子代培养物的延滞期就短。 ② 接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。（基数大） ③ 培养基成分 接种到营养丰富的天然培养基中的微生物，要比接种到营养单调的组合培养基中的延滞期短。

迟缓期出现的原因：调整代谢 在生产实践中缩短迟缓期的常用手段： (1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短； (2)利用对数生长期的细胞作为种子； (3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； (4)适当扩大接种量

2.对数生长期 又称指数期，是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。 特点： ①生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的代时G或原生质增加一倍所需的倍增时间最短； ②细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀； ③酶系活跃，代谢旺盛。 指数期的微生物可作为代谢、生理等研究的良好材料，是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。

指数生长期的三个参数 繁殖代数n：x2=x1·2n 以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2 生长速率常数R 世代时间G

影响微生物增代时间（代时）的因素 1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同； 2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短； 3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比； 凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成 分，就称为生长限制因子。 4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。

3.稳定期 又称静止期或最高生长期。 特点： 细胞数目不增加(R=0)，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 菌体产量达到了最高点，而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系 细胞长、大 代谢旺盛(RNA含量增加) 诱导酶迅速合成 对不良条件敏感，抵抗力降低

稳定期到来的原因主要是： ①营养物尤其是生长限制因子的耗尽； ②营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等； ③有害代谢产物的累积； ④pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜，等等。

此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，还促进了连续培养技术的设计和研究。 应用 稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期，也是对某些生长因子例如维生素和氨基酸等进行生物测定的必要前提。 此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，还促进了连续培养技术的设计和研究。 注意三条曲线：生长曲线、底物消耗曲线、代谢产物合成曲线。 　 在稳定期时，细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物。

4.衰亡期 特点： 个体死亡的速度超过新生的速度(繁殖数<死亡数)，整个群体就呈现出负生长（R<0）。 细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态； 有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶； 有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物； 在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期。

产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。 如：营养物耗尽，细菌利用贮存颗粒进行内源呼吸造成自身溶解；有毒代谢物积累，抑制细菌生长等。 在实际工作中多采用分光光度计测 定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。

活性污泥法的微生物的生长规律和纯菌种的一致，生长曲线也相似； 一般划为三个阶段：生长上升阶段、生长下降阶段、内源呼吸阶段

（二） 连续培养微生物的生长规律 在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定 的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。 培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是 实现微生物连续培养的基本原则。

恒浊连续培养 控制连续培养的方法 恒化连续培养 不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定 保持恒定的流速,使营养物质浓度保持恒定 连续培养装置示意图

1.恒化连续培养 概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。 原理：恒化器中动态平衡的稳定性，是以某种生长限制因子（如碳、氮源；生长因子；无机盐等）的浓度来控制菌的生长速度。 特点：维持营养成分的低浓度，控制微生物生长速率。

目前, 污水连续生物处理法均类似于恒化连续培养；（流速不完全恒定）

2.恒浊连续培养 概念：在恒浊器内，调节培养基流速，使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。 原理：维持菌浓度不变。 特点：基质过量，菌以最高速率生长；但工艺复杂，烦琐。 在恒浊连续培养中装有浊度计，借光电池检测培养室中的浊度(即菌液浓度)，并根据光电效应产生的电信号的强弱变化，自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。

连续培养的优点 连续培养的缺点： 易杂菌污染；菌种易退化 1、缩短发酵周期，提高设备的利用率； 2、便于自控。降低动力消耗及劳动强度； 3、产品均一。 连续培养的缺点： 易杂菌污染；菌种易退化

恒化培养和恒浊培养的比较 装 置 控制 对象 生长限制因子 培养液流速 生长 速率 产物 应用 范围 恒 浊 器 菌体 密度 无 不恒定 最高生长速率 大量菌体或与菌体相平行的代谢产物 生产 为主 化 培养液 流速 有 恒定 低于最高生长速率 不同生长速率的菌体 实验室

3.同步培养 同步生长：运用同步培养技术，控制微生物生长，使之处于同一生长阶段并同时分裂。 同步培养法：能获得处于同一生长阶段的群体细胞的培养方法。 同步培养（物）：用同步培养法所得到的培养物。

获得同步生长的方法： 同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传 特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。 温度 环境条件控制技术 温度 培养基成份控制 其他（如光照和黑暗交替培养） 机械方法 离心方法 过滤分离法 硝酸纤维素滤膜法 同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传 特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。

（三）在污水生物处理中的应用 污水连续处理中，细菌生长状态跟具体的生物处理方法有关，不同的生物反应构筑物，细菌的生长状态可能不同，甚至在同一个构筑物中，不同位置的细菌生长状态，但要以某种状态为主。

废水生物处理设计时，按废水的水质情况，可利用不同阶段的微生物处理废水。 如： 常规活性污泥法，生长下降阶段（减速、静止期） 生物吸附法，生长下降阶段（静止期） 高负荷活性污泥法，生长上升阶段（对数期），和生长下降阶段（减速期） 延时曝气法处理低浓度有机废水，利用衰亡期微生物

四、 微生物的生存因子 微生物正常生存，需要营养，除此以外，还需要合适的温度、pH、氧气等环境条件。

（一） 温度 温度对于微生物有那些影响？ 温度是微生物最重要的生存条件之一。 当处于最佳范围时，每上升10℃，酶促反应速度提高1～2倍。代谢速率和生长速率也提高，繁殖能力最强，微生物进行大量繁殖。 不同微生物对温度的要求不同。可将微生物分为嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌、嗜超热菌。

细菌 最低温度（℃） 最适温度（℃） 最高温度（℃） 嗜冷菌 －5～0 5～10 20～30 嗜中温菌 25～40 45～50 嗜热菌 30 50～60 70～80 嗜超热菌 55℃以上 70～105 110～113 低温、中温和高温细菌的生长温度范围

所有微生物中，多部分是嗜中温菌，其他较少。 污水处理系统中，为了保证微生物能够处于较好的工作状态，需要为其提供较适合的温度。一般控制在20～30℃左右。 冬天，需要进行加热处理。 如何加热？

（二）pH 微生物也有最适应的pH 范围，微生物不同，pH范围不同。 多数细菌：最佳6.5～7.5，适应范围4～10；一般要求中性或偏碱性； 放线菌：最佳7.5～8.0，一般要求中性或偏碱性； 霉菌和酵母菌：可在酸性或偏碱性环境生活，最喜欢3～6的环境。生长极限：1.5～10。

通常培养条件： 细菌： pH7.0~8.0 放线菌： pH7.5~8.5 酵母菌： pH3.8~6.0 霉菌： pH4.0~5.8

小结 1.污水处理生物处理构筑物内pH控制在6.5～8.5之间。 2.微生物培养过程中，培养基的pH值下降或上升，如何调控？（加入缓冲物质，或通过在线监测用泵加酸或碱） 3.污泥厌氧处理时，也要控制好pH，一般在6.6～7.6，最好控制在6.8～7.2之间。

氧化环境时， Eh为正，充满氧气时，上限为+820mV；还原环境时，mV为负，充满氢气时，下限为-400 mV。 （三）氧化还原电位 用Eh表示，单位为V或mV。 氧化环境时， Eh为正，充满氧气时，上限为+820mV；还原环境时，mV为负，充满氢气时，下限为-400 mV。 不同微生物要求的氧化还原电位不同： 1.一般好氧微生物：+300～+400 mV ，大于+100 mV，才能生活。 2.兼性菌：+100 mV为槛，大于时进行好氧呼吸，小于时进行无氧呼吸。 3.厌氧菌：－200～－250 mV。

好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3～+0.4伏为宜； 专性好氧微生物 兼性好氧微生物 微好氧微生物 厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长； 耐氧微生物 厌氧微生物

对于好氧生物处理系统，Eh 处于+200～+600mV视为正常。

（四）溶解氧 微生物与氧气的关系 好氧微生物 厌氧微生物 兼性微生物 专性好氧微生物 微量好氧微生物 专性厌氧氧微生物 耐氧厌氧微生物

微生物分类和氧的需求 分类 专性好氧菌 兼性厌氧菌 微好氧菌 耐氧菌 专性厌氧菌 培养物界面 仅培养表面和上层生长 培养表面和内部均有生长，上层更好 培养基表面之下的某一区域 培养下层比表面生长较好 仅培养底部生长 微 生 物 霉菌 产膜酵母， 醋酸菌，假单胞菌，微球菌大部分， 需氧芽胞杆菌，八叠球菌，无色杆菌，黄色杆菌，短杆菌属一部分。 大部分酵母 大部分细菌 肠杆菌科，葡萄球菌，气单胞菌，需氧芽胞杆菌一部分 霍乱弧菌、氢单胞菌、发酵单胞菌属 乳酸菌 梭状芽孢杆菌、 拟杆菌属、 甲烷球菌属

必须有氧才能生存，氧气对于好氧微生物的作用： 1.最终电子受体；2.参与物质合成 1.好氧微生物 必须有氧才能生存，氧气对于好氧微生物的作用： 1.最终电子受体；2.参与物质合成 好氧微生物做好氧呼吸时，会产生毒害物质如：过氧化氢、过氧化物羟自由基等。但由于好氧微生物体内也有相应的酶可以分解上述物质，因此，好氧微生物可以在氧气条件下正常生存。 好氧微生物所需要的氧气是溶解在水中的氧气，即DO。 溶解氧与大气压力及温度有关，温度越高，溶解氧越低。压力？

好氧生物处理系统中，为了保证微生物的正常工作，必须为它们提供足够的溶解氧。 工程上，通常采用鼓风曝气的形式向水中强制充氧。反应器中，采用何种方式？ 对于生活污水厂，BOD5200～300mg/L。如果曝气池的活性污泥浓度在2000～3000mg/L时，溶解氧必须保证在2mg/L以上。通常控制在3～4mg/L。 当供氧不足时，也会造成污泥的丝状菌膨胀。

2.厌氧微生物 可分为两种，一种有氧就要死亡；另一种，有氧无氧无所谓，生活过程中，不会中毒也不利用氧。 通常说的厌氧菌多指第一种，称为专项厌氧菌。它在有氧条件下，代谢过程中会产生过氧化氢，但体内不具有过氧化氢酶，专性厌氧微生物将被过氧化氢杀死。

厌氧微生物在培养时，培养基必须保证无氧。 方法： （1）惰性气体驱氧：氮气或氦气。 （2）用胶塞密封培养装置，并在容器中加入氧化还原性颜料（甲基蓝或刃天青），当在还原态时无色，氧化态时显色。一旦显色，说明有氧存在。 （3）可在培养装置中预先加入些兼性微生物混合培养，一旦有氧，可被兼性细菌消耗掉。

3.兼性厌氧菌 有氧无氧都能生存。 作用： 1.积极作用：a.污水处理 溶解氧充足时，好氧菌与兼性菌都起作用，当供氧故障时，兼性菌仍可起作用，但不如有足够溶解氧时处理效果好。 b.水解酸化 c.脱氮 2.消极作用：a.土壤脱氮，N素损失，土壤肥力下降。 b.产生亚硝酸胺

氧气与微生物的关系 类型 与O2关系 代谢类型 专性好氧 必须有氧 好氧呼吸 微好氧 有氧，含量低 兼性 可有、可无 有氧呼吸或发酵 专性厌氧 氧有毒害或致死 无氧呼吸 耐氧 可在有氧下存活，不用氧气 发酵

（2）霉菌生长的最低αw < 酵母 < 细菌 （五）水活度 1.微生物对αw的要求 （1）每种微生物有特征性的最适和最低αw （2）霉菌生长的最低αw < 酵母 < 细菌 微生物 aw 一般细菌 0.91 酵母菌 0.88 霉菌 0.80 嗜盐细菌 0.75 干性霉菌 0.65 嗜高渗酵母 0.60

2.引起食品变质的嗜盐微生物、耐盐微生物和耐糖微生物 （六）渗透压 1.不同类群微生物对渗透压适应性的比较 2.引起食品变质的嗜盐微生物、耐盐微生物和耐糖微生物 （1） 高度嗜盐细菌（最适宜在20～30%食盐浓度的食品中生长） （2） 中度嗜盐细菌（最适宜在5～18%食盐浓度的食品中生长） （3） 低等嗜盐细菌（最适宜在2～5%食盐浓度的食品中生长） （4）耐盐细菌 （能在10%以下的食盐浓度的食品中生长） （5）耐糖微生物 （能在高度的含糖的食品中生长）

五、微生物控制的原理和方法 （一）几个基本概念 1.消毒：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）。 2.灭菌：杀死包括芽孢在内的所有微生物。 3.防腐：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上生长。 4.无菌:没有活的微生物存在。 5.死亡：生长能力不可逆丧失

（二）微生物控制的两个基本策略 1.防止和杀死微生物 杀灭的物理因素 热 辐射作用 微波 超声波等 1）杀菌 2）抑制微生物生长 3）过滤除菌 4）保持无菌环境 2.促进有益微生物生长，使其抑制有害微生物生长

(三) 高温杀菌方法 烘箱内热空气灭菌 火焰灼烧 干热灭菌 湿热灭菌 （消毒法） 高温灭菌 巴氏消毒法 煮沸消毒法 间隙灭菌法

（四）冷藏抑菌 低温对微生物的影响 1. 低温可降低和停止微生物的繁殖 2. 致死作用：机械损伤生理干燥 3. 冷休克：由于温度快速下降，使微生物菌体尤其是处于对数生长期的菌体大量死亡的现象。

低温贮藏的方法 1. 寒冷温度 介于室温和冷藏温度之间 2. 冷藏温度 介于0~7℃之间 3. 冻藏温度 <0℃

（五）控制微生物的其它物理方法 1.辐射作用 辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波 杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。 用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和γ-射线等 2. 过滤作用 3.高渗、干燥、超声波等

（六）控制微生物的化学物质 生物合成的天然产物 抗微生物剂 人工合成的化合物 一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质

思考 1.典型生长曲线的四个阶段是什么？各有什么应用？ 2.pH过高或过低对微生物生长有什么影响？为什么污水生物处理的pH一般要维持在6.5以上？ 3.微生物培养过程中，什么原因使培养基pH下降？什么原因使pH上升？在生产中如何调节控制pH？ 4.好氧微生物培养中，如何控制溶氧浓度？

第二节 微生物遗传变异 微生物的遗传 微生物的变异 微生物遗传变异的应用

一、 微生物的遗传 遗传和变异是一切生物体最本质的属性之一。

（一）重要概念 遗传 指上一代生物如何将自身的一整套遗传基因传递给下一代的行为或功能。 遗传具有保守性 优点：保障优良性状稳定遗传； 缺点：环境变化，无法适应而死亡。

+ 遗传型 表型 又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。是一种内在的可能性或潜力。 指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的综合，是其遗传性在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体表现。是一种现实性。 遗传型 （可能性） + 环境条件 表型 （现实性） 代谢，发育

特点： 变异 指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，也是遗传型的改变。 出现几率低 性状变化幅度大 新性状稳定、可遗传

饰变 外表的修饰性改变，即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。 特点： 群体中的个体几乎都同样变化 性状变化的幅度小 不遗传

1.种瓜得瓜，种豆得豆； 2.龙生龙，凤生凤，老鼠儿子会打洞； 3.虎父无犬子； 4.一母生九子，母子十不同。 请大家想一想，与遗传变异有关的俗语或谚语有哪些？ 1.种瓜得瓜，种豆得豆； 2.龙生龙，凤生凤，老鼠儿子会打洞； 3.虎父无犬子； 4.一母生九子，母子十不同。

驯化 遗传是相对的，变异是绝对的。 利用物理因素、化学药物处理微生物提高其变异频率，可获得具有优异特性的变异菌株。 微生物遗传变异的应用 遗传是相对的，变异是绝对的。 利用物理因素、化学药物处理微生物提高其变异频率，可获得具有优异特性的变异菌株。 工业废水生物处理中，可以用含有某些污染物的废水筛选、培养菌种，使其适应并有高效降解其中污染物能力。 驯化

（二）遗传和变异的物质基础 1866年－奧地利孟德尔发表论文《植物杂交实验》，提出分离律、自由配合律等遗传定律。 1879年－德国生物学家弗来明在细胞核內发现了染色质 1903年－美国细胞学家萨顿发现，细胞染色体的活动方式，与孟德尔所描述的遗传因子极为类似。 1909年－丹麦的丹麦的植物遗传学家约翰逊开始以“基因”取代“遗传因子” 1910年－美国遗传学家摩根通过果蝇的研究，证明了基因存在染色体上 真正确立遗传物质：1944年后的3个著名实验。

哪些人用什么方法最终证明了 遗传的物质基础？ 1.格里菲斯经典转化实验（1928）及埃弗里、麦克劳德、麦卡蒂等人的转化补充实验（1941）。 2.赫西和蔡斯大肠杆菌T2噬菌体感染大肠杆菌实验。 3.H.Fraenkel-Conrat植物病毒的重建实验

证明遗传物质的三个经典实验 转化实验－－－遗传物质是DNA 噬菌体感染实验－－－证明DNA是遗传物质，且其中含有合成蛋白质的遗传信息 。 植物病毒重建实验－－－遗传物质是RNA。

格里菲斯——肺炎双球菌转化实验 多糖类荚膜 R型菌 （粗糙、 无毒性） S型菌 （光滑、 有毒性）

将R型活菌注入小鼠体内 一段时间后

将S型活菌注入小鼠体内 一段时间后

将灭活的S型菌注入小鼠体内 一段时间后

将R型活菌与灭活的S型菌注入小鼠体内 一段时间后 细菌发生转化，性状的转化可以遗传。

埃弗里、麦克劳德、麦卡蒂转化补充实验 从S型肺炎球菌活体上取得蛋白质、荚膜、DNA、RNA，分别与R型肺炎球菌混合后注入到小白鼠体内 结果被注入DNA的小白鼠死亡，其它小白鼠存活。

只有DNA引起R型肺炎球菌转化，DNA是其遗传物质 蛋白质 多糖 RNA 只有DNA引起R型肺炎球菌转化，DNA是其遗传物质

赫西和蔡斯实验——噬菌体侵染细菌的实验 （含S） （含P）

用放射性同位素35S标记外壳蛋白质 细菌内无放射性

用放射性同位素32P标记内部DNA 细菌内有放射性 表明DNA是遗传物质

植物病毒的重建试验 H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行植物病毒重建实验： 将TMV放在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将它的蛋白质外壳和RNA核心分离，发现裸露的RNA能感染烟草，而蛋白质不感染烟草。 选用一株与TMV近缘的霍氏车前花叶病毒HRV进行实验。

红蓝箭头表示遗传信息的走向 正常 花叶病 TMV重建试验

上述三个实验可以证明核酸是遗传物质。

课堂小结 核酸是一切生物的遗传物质，核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），绝大多数生物都是以DNA作为遗传物质的，因此DNA是主要的遗传物质。

生物的遗传物质： 蓝藻 细菌 动植物 噬菌体 流感病毒 艾滋病毒 烟草花叶病毒 含DNA的生物： 以DNA为遗传物质 　噬菌体　　　 流感病毒　　 艾滋病毒　 烟草花叶病毒 生物的遗传物质： 含DNA的生物： 以DNA为遗传物质 如真核生物、原核生物和只含DNA的病毒等 如流感病毒、爱滋病病毒、烟草花叶病毒等 以RNA为遗传物质 仅含RNA的生物： 　噬菌体　　　 流感病毒　　 艾滋病毒　

沃森（左）和克里克与DNA分子双螺旋结构模型 （三）DAN的结构与复制 1.DNA结构 最经典的结构：双螺旋结构。 沃森、克里克1953年提出。 沃森（左）和克里克与DNA分子双螺旋结构模型

1.DNA的结构 DNA有两条核苷酸链彼此围绕同一根轴互相盘绕形成，为双螺旋结构。 每个单链均由脱氧核糖－磷酸－脱氧核糖－磷酸交替排列构成。每个核苷酸链上都有四个碱基： T——胸腺嘧啶 A——腺嘌呤 G——鸟嘌呤 C——胞嘧啶 彼此与另一条核苷酸链上的碱基组成碱基对：T—A A—T G—C C—G

磷酸 脱氧 核糖 碱基 碱基 T A G C

A G C T 脱氧 核糖 磷酸 碱基

A T G C A T G C

一个DNA分子可包含几十万到几百万个碱基对，每个碱基之间间距为0.34nm。每10个碱基组成一个螺旋，螺距3.4nm。 碱基之间一一对应，顺序固定，可以保证遗传的稳定性。 如果受到干扰，个别碱基排列顺序发生变化，会导致微生物死亡或变异。

2.DNA的存在形式 主要在细胞核中，以染色体形式存在，酸性。 另外还有质粒等。

3. 基因 存在染色体上，是一切生体内储存遗传信息的、有自我复制能力的遗传功能单位。 基因特别是指在DNA序列上，能够表现出功能的部分 基因按功能可分三类：结构基因、操纵区、调控基因 在人类的所有染色体上，约存在30,000个基因 有时单一个基因便能控制一种性状的表现，然而，大部分的生理性状，都是由一系列相关的基因一同调控而表現

二、微生物的变异 微生物突变的类型很多，按突变体的表型，可分为以下几种主要类型。 1.形态突变型 形态突变型是指微生物发生了可见的细胞形态变化或菌落形态改变的突变型。 2.生化突变型 1）营养缺陷型 2）抗性突变型 3）发酵突变型 4）毒力突变型 5）产量突变型

（三）条件致死突变型 条件致死突变型是指在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下却不表现致死效应的突变型。如某些突变体的大肠杆菌在40℃或在43 ℃时不能生长，而在37 ℃则可以生长。 （四）致死突变型 致死突变型是指由于突变而丧失生活力造成个体死亡的突变型。

突变 变异的实质——基因突变 基因突变： 自发突变 诱变 简称突变，是变异的一类，泛指细胞内（或病毒颗粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。 基因突变： 突变 自发突变 诱变 环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等 而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9 。 某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接 作用，突变以较高的频率产生。

1.基因突变的特点 ①自发性—— 在无人为诱发因素的情况下，各种遗传性状的改变可以自发地产生。 ①自发性—— 在无人为诱发因素的情况下，各种遗传性状的改变可以自发地产生。 ②不对应性——指突变性状（如抗青霉素）与引起突变的原因间无直接对应关系， ③稀有性—— 自发突变不可避免，但突变的频率极低。 ④独立性—— 各种性状彼此间独立 ⑤可诱导性——通过物理、化学诱发，提高突变率 ⑥稳定性—— 突变后新的遗传性状是稳定的 ⑦可逆性—— 实验证明，任何突变既可能正向突变，也可发生回复突变，频率基本相同。

2.基因突变的机制 ⑴ 诱发突变：简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。 ①碱基的置换；②移码突变；③染色体畸变。 ⑵ 自发突变：指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。 形成原因： ①背景辐射和环境因素的诱变；②微生物自身有害代谢产物的诱变；③又DNA复制过程中碱基配对错误引起。 ⑶ 紫外线（UV）对DNA的损伤及其修复 ①光复活作用；②切除修复；③重组修复作用；④紧急呼救（SOS）修复。

第三节 菌种保藏与复壮 一、菌种保存 （一）保存目的：保持菌种原有的性状和生活能力，不发生变异，不被其他杂菌污染，不死亡，以便能够很好地研究和利用微生物。 （二）保存原理：根据微生物的生理、生化特性、创造条件（低温、干燥、缺氧等）使其代谢处于不活泼的休眠体（分生孢子或芽孢）状态，生长繁殖受到抑制，从而减低菌种的变异率。 （三）保存方法： 1.低温保存法：4℃，－196～－150 ℃（超低温） 2.隔绝空气保存法：液体石蜡保存法，橡皮塞密封保存法。 3.干燥保存法：砂土管保存法，真空冷冻干燥法，麸皮保存法，寄主保存法（活体保存法，病原菌，病毒）

二、菌种的衰退与复壮 （一）菌种的衰退 1.衰退表现：菌落和细胞形态改变，生产性能或对寄主寄生能力下降，抗不良环境条件能力减弱。 2.衰退原因：基因突变，育种后未经很好的分离纯化，不良的环境条件，污染杂菌。 3。预防衰退：控制传代次数，利用不同类型的细胞接种传代，创造良好的培养条件，采用有效的保存方法。 （二）菌种的复壮 1.纯种分离（未退化的） 2.通过寄主体复壮 3.淘汰已衰退的个体

几种常用菌种保藏方法的比较 方 法 名 称 主 要 措 施 适 宜 菌 种 保 藏 期 评 价 冰箱保藏法 （斜面） 低温（4℃） 各大类 评 价 冰箱保藏法 （斜面） 低温（4℃） 各大类 3-6月 简 便 （半固体） 低温（4℃）,避氧 细菌，酵母菌 6-12月 石蜡油封藏法 低温（4℃）,缺氧 各大类** 1-2年 砂土保藏法 干燥，无营养 产孢子的微生物 1-10年 简便有效 冷冻干燥保藏法 干燥，无氧，低 温，有保护剂 5-15年以上 繁而高效 液氮保藏法 超低温（－196℃）, 有保护剂 15年以上 甘油悬液保藏法 低温（－70℃），保护剂甘油 约10年 较简便 *用斜面或半固休穿刺培养物均可。一般置4℃冰箱保藏。 **石油发酵微生物不适宜。