情境四 中药中香豆素类化学成分的提取分离技术

理论基础 任 务

理 论 基 础 一、结构与分类 二、理化性质 三、检识方法 四、提取与分离方法

一、结构与分类 香豆素是顺式邻羟基桂皮酸的内酯，具有芳香气味，广泛分布于高等植物中，在生物体内以邻羟基桂皮酸苷的形式存在，酶解后苷元邻羟基桂皮酸内酯化成香豆素，具有荧光性及多种生物活性。

一、结构与分类 1、基本母核：苯骈α-吡喃酮（色原酮的异构体） （邻羟桂皮酸内酯）

一、结构与分类 2、分布 香豆素类在动植物及微生物中均有分布，如致癌成分黄曲霉素类及发光真菌中的亮菌素类均属于香豆素类。这类成分分布得最广的还是高等植物中，其中芸香科和伞形科中分布最多。它们在植物体内以游离状态或与糖结合成苷的形式存在，苷酶解可环合成游离的内酯状态。

一、结构与分类 3、香豆素的结构类型 香豆素母核的苯环或α-吡喃酮环上常有羟基、烷氧基、苯基、异戊烯基等取代，其中异戊烯基的活泼双键又可与邻位酚羟基环合成呋喃或吡喃环结构，根据其取代基及连接方式不同，把香豆素分成几类：

（一）简单香豆素类 苯环上有取代基 指只有在苯环上有取代基的香豆素类。如白蜡树枝皮

白蜡树的枝皮或干皮的主要成分：七叶内酯和七叶苷

（二）呋喃香豆素类 香豆素核上的异戊烯基与邻位酚基环合 成呋喃环，成环后常伴随着降解失去三个碳原子。 异戊烯基与邻位酚羟基环合 （1）直线型：C6-异戊烯基与C7-羟基环合而成（6、7呋喃骈香豆素型）如：补骨脂内酯 （2）角型：C8-异戊烯基与C7-羟基环合而成（7、8呋喃骈香豆素型）如：异补骨脂内酯

（三）吡喃香豆素类 香豆素的C6或C8异戊烯基与邻酚羟基环合而成2、2-二甲基-α-吡喃环结构。

美洲花椒

茵陈蒿

异香豆素可认为是邻羧基苯乙烯醇的内酯，香豆素的异构体。 （四）异香豆素类 异香豆素可认为是邻羧基苯乙烯醇的内酯，香豆素的异构体。 （五）其它香豆素类 α-吡喃环上有取代基的香豆素类。C3、C4上常有苯基、羟基、异戊烯基等取代。C3苯代香豆素生源同黄酮。

三、生理活性 1.毒性：肝毒性 。必要结构：呋喃环上的双键和不饱和内酯环。 2. 抗菌作用：秦皮中的七叶内酯和七叶内酯苷具抑制痢疾杆菌的作用。补骨脂内酯具抗真菌及抗结核活性。 3.平滑肌松弛作用：血管扩张作用。 伞形科凯刺-----------冠状动脉扩张 茵陈蒿滨蒿内酯-----解痉利胆 4.抗凝血作用和止血作用： 双香豆素----防血栓及消血块 泽兰内酯----止血

5.光敏作用 补骨脂内酯治疗白癜风。 呋喃香豆素多有该作用。很多香豆素可以吸收紫外光，放出在可见区（近470nm）的荧光，故可用做增白剂，如7-OH香豆素。由于吸光性，七叶内酯和七叶苷可用于保护皮肤防止辐射的药物。

二、理化性质 （一）性状 游离苷元：无色至淡黄色结晶，具有芳香性和挥发性； 苷类：粉末状，多数无香味和挥发性。 （二）溶解性 游离苷元：溶于沸水，但不溶于冷水。溶于氯仿、乙醚、醋酸乙酯、丙酮、甲/乙醇等有机溶剂。 苷：易溶于甲/乙醇，可溶于水，难溶于乙醚、氯仿、醋酸乙酯等有机溶剂。

（三）内酯性质和碱水解反应 1、香豆素的α-吡喃酮环具有α，β-不饱和内酯性质，在稀碱液中会逐渐水解生成顺邻羟桂皮酸的盐，而顺邻羟桂皮酸不易游离存在，其盐的水溶液经酸化即闭环恢复成内酯。这个闭合过程极易发生，即使在很弱的酸溶液中，如通入CO2也能促使其内酯化而闭环。

2、香豆素如果和碱液长时间加热，水解产物顺邻羟桂皮酸衍生物则发生异构化，转变成反邻羟桂皮酸的盐，再经酸化也不再发生内酯化闭环反应。 （1）香豆素内酯环发生碱水解的速度主要与C7位取代基的性质有关。其水解难易为： C7-OH香豆素﹤C7-OCH3香豆素﹤香豆素 （2）C8的适当位置有羰基、双键或环氧结构时，其水解可获得顺邻羟桂皮酸的衍生物，而不再闭环成内酯。

（四）荧光性 香豆素母体本身即无取代的香豆素并无荧光。羟基香豆素类化合物在紫外光下大多显蓝色或蓝绿色荧光，在碱液中更加显著，尤其是C7羟基香豆素，甚至在日光下也可辨认。若在C8或C6再引入羟基，则荧光减弱。引入甲氧基后荧光也将减弱，颜色转变为紫色。

三、检识方法 香豆素类分子中均具有内酯结构，通常还具有酚羟基或内酯水解后产生的酚羟基，通过这些基团的显色反应，能为检识与鉴别香豆素成分提供参考。 1、异羟肟酸铁试验（内酯的颜色反应） 具有内酯结构，在碱性条件下内酯开环，与盐酸羟胺缩合成异羟肟酸，在酸性条件下再与Fe3+络合生成异羟肟酸铁显红色。 2、酚羟基反应 （1）与三氯化铁的乙醇液反应，产生绿色现象，取代基越多，颜色越深。

（2）若酚羟基邻、对产生的酚羟基对位无取代基，或水解后基，可与一些试剂缩合显色。 1）重氮化试剂（如重氮化对硝基苯胺）缩合显红至紫红色。 2）与Gibbs试剂（2、6-二氯苯醌氯亚胺）缩合显蓝色。 3）与Emerson试剂缩合显红色。Emerson试剂：4-氨基安替比林和铁氰化钾。

3、色谱检识 1、TLC 2、PC 常用的吸附剂是硅胶，其次是纤维素和氧化铝； 一般采用中等极性的混合溶剂或偏酸性的混合溶剂。 显色方法：首选观察荧光，或用氨熏，喷10%氢氧化钠后再观察。 2、PC 常用水饱和的正丁醇、异戊醇、氯仿为展开剂； 展开剂的PH值可影响弱酸性香豆素的Rf值。

四、提取与分离方法 （一）提取 1、溶剂提取法 2、酸碱提取法 （二）分离 1、分步结晶法 2、真空升华或蒸馏法

1、系统溶剂法： 用石油醚、苯、乙醚、乙酸乙酯、丙酮和甲醇依次提取样品。 石油醚回流提取 石油醚液 回收至小体积 浓缩液 放置、析晶 粗晶 冷石油醚洗 结晶（可能时混和物） 进一步分离 单体（亲脂性香豆素） 残渣 乙醚液 乙醚回流提取 回收分离 单体（亲脂性较弱香豆素） 乙醇提取 香豆素苷类 药材粗粉 乙醇液

2、酸碱分离法 此系经典方法。 1.具酚羟基的香豆素类溶于碱液加酸后可析出。 2.香豆素的内酯环性质，于碱液中皂化成盐而加酸后恢复成内酯析出。 碱液加热开环时，要注意碱液的浓度和加热时间，否则将引起降解反应而使香豆素破坏，或者使香豆素开环而不能合环。 对酸碱敏感的香豆素用此法可能得到次生产物。

3、水蒸气蒸馏法 某些小分子的香豆素类具挥发性可用蒸馏法与不挥发性成分分离，常用于纯化过程。

任务 秦皮中香豆素类化学成分的提取分离技术 任务 秦皮中香豆素类化学成分的提取分离技术 秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树、白蜡树、尖叶白蜡树、宿柱白蜡树的干燥枝皮或干皮。 味苦，性寒。归肝、胆、大肠经。有清热解毒、收涩、明目之功效。 秦皮中主要含有香豆素类化合物：七叶苷及七叶树内酯（七叶素）、秦皮苷、秦皮素、紫丁香苷等。

知识链接 以95%乙醇为溶剂提取； 浓缩液加热后用氯仿洗涤，除去脂溶性杂质； 利用七叶苷和七叶素在醋酸乙酯中的溶解度不同而分离。

思考题 1、香豆素类化合物具有哪些理化性质？ 2、简述薄层色谱中展开剂的PH值对弱酸性香豆素Rf的影响。 3、通过提取分离秦皮中的七叶素和七叶苷，试述两相溶剂萃取法的原理是什么？操作时要注意哪些问题？萃取操作中若已发生乳化应如何处理？

系统溶剂分离法 1、定义 按极性由小到大的顺序选用不同极性的溶剂组成溶剂系统，依次提取分离提取液中各种不同成分，使各溶解度有差异的成分得到分离。 2、该法的特点：可分离不同极性的有效成分（初始研究阶段） 3、该法的缺点：繁琐，分离纯化度不高，灵敏性下降

3、中药化学成分及其较适用范围的提取溶剂 知识链接 植物成分结构类型 适于提取溶剂 亲脂性强 叶绿素、脂肪油、挥发油 石油醚 亲脂性较强 游离生物碱、苷元、甾类、萜类、某些有机酸 乙醚、氯仿 中等 极性 中偏小 某些苷类 (如强心苷等) 氯仿-乙醚 (2:1) 中 等 某些苷类 (如黄酮苷类) 乙酸乙酯 中偏大 某些苷类 (如蒽醌苷、皂苷等) 正丁醇 亲水性较强 极性大的苷、糖类、氨基酸等 丙酮、乙醇、甲醇 亲水性强 蛋白质、粘液汁、糖类、氨基酸、无机盐、苷类 水

两相溶剂萃取法 1、原理 ：利用混合物中各种成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的差异而达到分离的目的。 1）分配系数（K值）与萃取次数的关系 K=C u/C l K值与萃取次数成反比， K值越大，萃取次数越少，反之越多 各种成分在两相当中溶质的浓度相差越大，即分配系数K差异越大，则分离效果就越好。 2）分离因子（β值）与分离难易的关系 β = KA / KB β值越大，越易分离； β值 → 1时，无法分离

分配色谱法 分配色谱法 基本原理 反相 色谱 正 相 分 配 色 谱 反 相 分 配 色 谱 正相 色谱 极性物质吸附强 后出 先出 非极性物质吸附弱 极性物质吸附弱 反相 色谱 先出 后出 非极性物质吸附强

（一）基本原理 （二）支持剂 （三）分配色谱种类 正相分配色谱 反相分配色谱 （四）操作方式 1.纸色谱 2.分配薄层色谱 3.分配柱色谱

3）纸色谱（PC） 支持剂：滤纸 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：一定的溶剂系统。