蛋白质与酶分子设计与改造 最新进展 PBL-2

小组成员 刘用祥：组长，统领全局 孙亚楠：演讲者、PPT制作 任依佳：副组长 执行、PPT制作 杨洁、谭品华： 具体PRO改造 李良华、赵商： 机动组 石一豆、陈应婷：文献搜集 白书连、李加本： 资料汇总

1 概况 2 最新进展及应用 3 3 具体实例 4 4 存在问题及展望

蛋白质分子设计流程图 蛋白质结构预测 蛋白质晶体学 蛋白质三维结构 结构与功能关系 从数据库输入 蛋白质突变体设计及结构预测 天然蛋白质 蛋白质结构预测 蛋白质晶体学 蛋白质三维结构 结构与功能关系 从数据库输入 蛋白质突变体设计及结构预测 几何优化及蛋白质动力学研究 结构分析与原先的结构比较 蛋白质合成定位突变 分离、纯化及表征 新蛋白质

蛋白质设计的目标及解决办法 热稳定性 对氧化的稳定性 对重金属的稳定性 pH稳定性 提高酶学性质 　　　蛋白质设计的目标及解决办法 设计目标 解决办法 热稳定性 对氧化的稳定性 对重金属的稳定性 pH稳定性 提高酶学性质 引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积，增加表面盐桥 把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu，把Trp转换为Phe或Tyr 把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基 替换表面荷电基团His、Cys以及Tyr的置换，内离子对的置换 专一性的改变，增加逆转数(turnover number)，改变酸碱度

新药研究 疫苗设计 工业酶的研究 双特异性抗体 最新进展及应用 疫苗设计 工业酶的研究 　工业酶的研究 双特异性抗体 双特异性抗体：是治疗癌症的最新研制药物，可识别两种抗体，一个负责识别肿瘤细胞，对药物进行导航，直达病变细胞处，另一个则起功能效应，针对癌变进行治疗，可有效抑制癌细胞的扩散，促其聚集并集中消灭，对于刁钻癌变部位如骨癌、脑癌等不易进行手术的癌变部位的治疗有深刻意义。http://www.yzybio.com/yfxm.asp?id=9 药用酶分子设计：可改变酶的催化特性、底物专一性和辅基专一性，使酶能进一步的发挥其治疗调理作用，这种新型药用酶对于针对代谢紊乱引起的疾病疗效甚佳。 疫苗设计 可以有效提高其亲和性和安全性，人体对肽片段不会有病害反应，同时也能够很有效地促抗体产生，是更为理想的疫苗材料。 　工业酶的研究 在工业生产中酶的运用也十分广泛，很多食品的发酵生产、农产品深加工，都离不开酶。运用蛋白质工程的方法提高酶的活性、特异性、稳定性，改变反应介质和动力学性质，进而可以改进现有的工业用酶，降低生产成本，提高生产效率，改良产品品质。 6

TGFα3-mSEA融合蛋白连接肽长度的设计 实例 TGFα3-mSEA融合蛋白连接肽长度的设计 Who & where 融合蛋白的表达、纯化、活性测定工作由 浙江大学 1. 肿瘤研究所, 2. 免疫学研究所, 3. 医学院细胞与分子生物学实验中心 的 马文学博士完成

融合蛋白中连接肽的长度对融合蛋白的功能活性有很大的影响。确定合适的连接肽的长度非常重要。 金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）是一种具有超抗原活性的细菌毒素，将TGFα(Transforming growth factor )的第三环区与SEA进行融合，将有可能实现超抗原对EGFR高表达肿瘤细胞的靶向治疗。 融合蛋白中连接肽的长度对融合蛋白的功能活性有很大的影响。确定合适的连接肽的长度非常重要。 超抗原是指一类逆转录病毒蛋白和细菌外毒素，它们无需抗原递呈细胞的加工，而能直接与抗原递呈细胞的 MHC及T细胞的TCR结合，并激活 T细胞，由于这类抗原以微量存在时，即可激活大量的T细胞，所以称为超抗原。 8

选择了两种TGFα3-mSEA融合蛋白进行结构模建： mTSA 含长连接肽（8肽）的TGFα3-mSEA mTSB 含短连接肽（5肽）的TGFα3-mSEA 然后通过对两种融合蛋白结构的比较来确定连接肽长度 模建策略： 根据我们的方法，拟采取以下步骤： 重点放在优化结构方面

模建过程： 以SEA的结构作为模板， 模建融合蛋白中SEA，连接肽作为loop用分子力学手段直接生成， TGFα3的结构根据TGFα的NMR结构直接拷贝。 结构的优化： 固定融合蛋白质中的SEA及TGFα3部分的结构，只对连接肽进行优化，优化至能量收敛，得到能量优势构象。 进行融合蛋白分子的整体的结构优化至能量收敛，最终的能量优势构象作为融合蛋白的结构。

mTSA（连接肽为8肽的TGFα3-mSEA融合蛋白）空间结构 8肽连接肽 mTSA（连接肽为8肽的TGFα3-mSEA融合蛋白）空间结构

mTSB（连接区为5肽的TGFα3-mSEA融合蛋白）的空间结构 5肽连接肽 mTSB（连接区为5肽的TGFα3-mSEA融合蛋白）的空间结构

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TGFα3-mSEA分子中SEA与天然SEA结构的比较   CA backbone Heavy mTSA 0.31 Å 0.39 Å 3.13 Å mTSB 0.41 Å 0.50 Å 3.60 Å TGFα3-mSEA分子中TGFα3与天然TGFα结构的比较   CA backbone mTSA 0.79 Å 0.89 Å mTSB 0.92 Å TSA：8肽 TSB：5肽 根据结构模建得到的结论： TGFα3-mSEA融合蛋白中的连接肽为5个氨基酸时，对TGFα3和SEA影响较大，8个氨基酸的linker对两者空间构象影响较小。 推论：8个氨基酸的linker对功能影响小。 推论：8个氨基酸的linker对功能影响小。 14

实验验证 mTSA与A431细胞结合的特异性试验 融合蛋白与A431细胞结合的剂量曲线 A.Positive control EGF; B. pmTSA ; C. mTSA binding blocked by EGF; D. Blank control :PBS

不同蛋白刺激脾细胞增殖活性试验

实验结论： 受体特异性结合试验及激光共聚焦分析表明，融合蛋白mTSA能特异性地结合到A431的EGF受体。 融合蛋白与脾细胞共培养，mTSA （8肽的linker TGFα3-mSEA融合蛋白 ）比mTSB（ 5肽的linker TGFα3-mSEA融合蛋白 ）更能显著促进脾细胞的增殖 。

蛋白质分子设计目前存在的主要问题： 缺乏结构的独特性及明显的功能优越性 三级结构的确定性较差 技术人员的水平要求极高 技术设备及经费投入欠缺 研究方向太狭隘 价格高昂，消费范围受限 消费者认知局限　 目前存在的主要问题： 设计的蛋白质与天然蛋白质相比缺乏结构的独特性及明显的功能优越性 设计的蛋白质有正确的形貌、显著的二级结构及合理的热力学稳定性，但三级结构的确定性较差 　技术人员：蛋白质分子设计对技术人员的水平要求极高。 技术设备及经费：除国家指定工程项目有研究资金，大部分私有企业的研究所往往支付不起，投入欠缺。 　 研究方向太狭隘：在蛋白质分子设计方面的研究往往具有局限性。 　价格高昂，消费范围受限：高昂的价格使得消费者望而却步，使用渠道的堵塞反过来将会导致生产的堆积和资金短缺，进而限制进一步的研究设计。 　消费者认知局限：如同现在很多人对转基因食物抱有怀疑态度，公众认知的缺乏同样会导致生产滞销和资金困难，进而限制研究。 18

发展趋势 工业：应用前景将会是最为广泛的，利用蛋白质分子设计可以改良酶性质，增强生物材料耐性，一方面可以加强生产设备，一方面可以改良产品品质。 农林业：生产具有强针对性的激素、酶、杀虫剂等物质，并加强对病虫害的针对性。 牛奶中提取的彩色蚕丝 医药：尝试用蛋白质分子设计针对其病原体研制有效疫苗或治疗药物，还可用于人造组织、人造器官的亲和性改良，断骨黏合技术等方面。 其他: 电缆通讯、生物骨架、克隆、人工智能、石油勘探、危险品侦测、危险品警告、电子科技、航空航天等等方面 从牛奶中提取的彩色蚕丝 农林业：可以通过蛋白质分子设计生产具有强针对性的激素、酶、杀虫剂等物质，可应用在植物组织培养的培养基，花卉树木生产、农作物生产的杀虫剂和促生长剂等等，尤其是在农药方面可进行改良，避免农药试剂对土壤和地下水的污染，并加强对病虫害的针对性。 工业：蛋白质分子设计在工业上的应用前景将会是最为广泛的，从重工业到轻工业，很多方面都可能用到酶、生物材料等等，利用蛋白质分子设计可以改良酶性质，增强生物材料耐性，一方面可以加强生产设备，一方面可以改良产品品质。 胶原蛋白 19

参考文献

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