临床免疫检验的质量管理和标准化：问题与思考 李金明 国家卫生计生委临床检验中心

？ 免疫检验的发展历程 国内的应用现状 质量管理？质量保证？标准化？ 临床免疫检验应用的主要问题 性能验证 室内质量控制？室间质量评价？ 未来的发展

免疫检测技术的发展阶段 1896年，肥达试验（Widal test）（免疫凝集试验） 1897年，免疫沉淀试验 1900年，红细胞凝集试验和补体结合试验（Complement fixation test, CFT） 1902年—1970年代：免疫沉淀试验（环状沉淀试验-试管单向免疫扩散试验-平板单向放射免疫扩散试验-平板法双向免疫扩散试验-免疫电泳（免疫固定电泳、对流免疫电泳和火箭免疫电泳）-免疫透射比浊、免疫散射比浊和免疫胶乳增强比浊 1941年— 标记免疫测定技术（荧光抗体技术、放射免疫试验、酶免疫测定技术、酶联免疫吸附试验、均相(Homogeneous)酶免疫测定技术、克隆酶供体免疫测定（CEDIA）、化学发光免疫测定技术、纳米和量子标记技术）。 Eva Engvall (左一），Peter Perlmann 左三） Georges Widal Karl Landsteiner  Rosalyn Yalow

诊断医学 70%以上信息来自实验室 理论上任何一种物质只要能得到其特异抗体，均可建立免疫测定方法！ 预测 诊断 监测 预后 免疫和分子诊断是整个检验医学领域内发展最快、最有活力的，在疾病的诊断和治疗中往往有决定性作用！ 诊断医学 70%以上信息来自实验室 理论上任何一种物质只要能得到其特异抗体，均可建立免疫测定方法！ 预测 诊断 监测 预后

临床检验的发展历程 三大常规检验（血、尿、便） 生化检验（血糖、离子等） 微生物检验（细菌培养+药敏） 免疫检验（颗粒凝集试验、免疫沉淀试验、放射免疫试验、ELISA、化学发光免疫试验等） 分子诊断（HBV等感染性疾病、遗传病、个体化治疗用药医学检测等）

常用的免疫检验项目及检测方法 感染性疾病特异抗原和抗体（乙肝“两对半”、抗-HCV、抗-HIV、梅毒抗体、TORCH等）：ELISA、化学发光免疫试验（CLIA） 自身抗体：ELISA、CLIA、间接免疫荧光试验 肿瘤标志物：CLIA、ELISA 激素：CLIA 特定蛋白：散射比浊和透射比浊

质量保证 标本采集、运送和保存（分析前） 结果报告解释及应用（分析后） 室内质控（分析中） 室间质评（分析中） 涉及标本采集环节人员和实验室 涉及实验室人员和临床医生 涉及实验室 涉及实验室

是有效实现（质量）目标，所有的管理行为，都是为实现（质量）目标服务的 “（质量）管理”的定义 ●管理就是通过计划、组织、领导和控制，协调以人为中心的组织资源与职能，以有效实现（质量）目标的社会活动。 含　义 具　　体　　理　　解 管理的目的 是有效实现（质量）目标，所有的管理行为，都是为实现（质量）目标服务的 实现目标的手段 是计划、组织、领导和控制 管理的本质 是协调 管理的对象 是以人为中心的组织资源与职能活动

质量管理的内涵 写你所应做的 做你所写的 记录你已做的 分析你已做的

标准化 标准化是对实际与潜在的问题作出统一规定，供共同和反复使用，以在预定的领域内获取最佳秩序和效益的活动。

临床免疫检验应用中的主要问题 肿瘤标志物 感染性疾病病原体特异抗原抗体

筛查试验 用于检测整个人群或部分人群中待测物（感染性病原体抗原或相关抗体）的存在情况。 一般而言，筛查试验应当具有较高的临床敏感性（即临床检出率大于95%） 对其特异性的要求（和阳性预测值）则取决于对各种因素的综合考虑，例如假阳性结果是否会对被检测人经济上或心理上产生严重的不良影响、对误诊病例的治疗是否会产生严重的后果（例如，由于风疹抗体水平较高，而怀疑妊娠期感染，为避免感染造成的不良后果，需要进行流产手术以终止妊娠）、是否有可以对阳性筛查结果进行确认的方法、确认是否易于执行、确认方法是否价格昂贵等。 通常情况下，筛查试验结果阴性提示被检测人待测物阴性的可能性很高，而筛查试验结果阳性仅提示阳性结果的可能，但需要进一步的确认。

诊断试验 诊断试验用于检测临床上已怀疑某种病原体感染的患者中待测物（感染性病原体抗原或相关抗体）的存在情况。 如果待测的感染性病原体抗原或相关抗体对于治疗以及判断预后有重要意义，则该诊断试验应当具有足够高的敏感性。 如果试验的结果可以很容易地通过确认试验进行确认，且确认试验的准确性高，那么对诊断试验的特异性要求可适当降低。 临床上，大多数对感染性疾病的免疫测定属于诊断试验。

确认试验 确认试验用于验证筛查试验或者诊断试验结果的确认。 对于确认试验，特异性和阳性预测值比敏感性和阴性预测值更为重要，确认试验的特异性应当大于98~99%。 确认试验可以是免疫测定，也可以是培养或核酸检测。 用于确认试验的免疫测定方法有免疫印迹试验（WB）、重组免疫印迹（RIBA）、抗体中和试验等。 在大多数情况下，一种试验方法如果不属于筛查试验或诊断试验，那么就应当属于确认试验。 如果筛查试验或者诊断试验本身的特异性和阳性预测值就很高，那么就没有必要再使用确认试验进行结果的确认。

阳性预示值 临床上，阳性预测值为一检测试剂或方法测定阳性标本实际上为阳性的可能性。 ×100%

阴性预示值 临床上，阴性预测值为一检测试剂或方法测定阴性标本实际上为阴性的可能性。 ×100%

预示值对一个有99%敏感性和99%特异性的试剂检测结果的影响（100,000人） 结 果 50%感染率 30%感染率 10%感染率 1%感染率 0.5%感染率 检出 (+) 未检出 (－) 检出(+) 未检出(－) + 49,500 500 29,700 300 9,900 100 990 10 495 5 － 700 69,300 900 89,100 98,010 995 98,505 敏感性(TP/[TP+FN]) 99% 特异性(TN/[TN+FP]) 阳性预示值 TP/[TP+FP] 49500/[49500+500]=99.0% 29700/[29700+700]=94.6% 9900/[9900+900]=91.67% 990/[990+990]=50% 495/[495+995]=33.2% 阴性预示值 TN/[TN+FN] 69300/[69300+300]=99.6% 89100/[89100+100]=99.89% 98010/[98010+10]=99.99% 98505/[98505+5]=99.99%

肿瘤筛查

问题 肿瘤标志物可作为肿瘤筛查诊断使用吗？ 目前较好的肿瘤标志物用于肿瘤诊断的特异性和敏感性能达到多少？

美国国家临床生化学会（NACB）最新的指南指出，将以前认为最具器官特异的PSA建议不作为前列腺癌筛查标志，但可作为疾病复发和治疗监测标志。游离PSA测定在总PSA<10 µg/L时，可作为区分良性和恶性前列腺疾病的标志。 Sturgeon CM, et al. National Academy of Clinical Biochemistry. National Academy of Clinical Biochemistry laboratory medicine practice guidelines for use of tumor markers in testicular, prostate, colorectal, breast, and ovarian cancers. Clin Chem. 2008;54(12):e11-79.

结论 由于肿瘤标志物对特定肿瘤的诊断特异性和敏感性均较低，一般不适用于正常人群的肿瘤体检筛查。 但可用于高危人群的体检，如有特定肿瘤家族史、有症状、有特定疾病如慢性肝炎病毒感染者和肝硬化等者，以及年龄较大者，可以体检加入特定肿瘤标志的检测，如AFP、PSA、CEA、hCG等，但应就相应阳性检测结果，向患者做出恰当的解释及进一步检查观察的建议，避免应解释不当而出现患者焦虑不安的情况。

肿瘤早期诊断

能成为现实吗？ 关于肿瘤的早期诊断乃至预测，一直是肿瘤标志研究者们的梦想，也是多年来很多课题研究的目标，也有不少研究论文发表，截止到2009年5月，在PubMed上同时输入Tumor marker 和early diagnostics，会搜索到162个Items。但至今为止，人们仍然没有找到可以明确进行肿瘤早期诊断的标志，实际上，这也是一个在目前不太可能实现的梦想。

肿瘤的早期发现还得依赖于影像诊断。如美国国家临床生化学会（NACB）最新的指南指出, CA125与阴道超声一起可作为高危女性卵巢癌早期诊断指标。 Sturgeon CM, et al. National Academy of Clinical Biochemistry. National Academy of Clinical Biochemistry laboratory medicine practice guidelines for use of tumor markers in testicular, prostate, colorectal, breast, and ovarian cancers. Clin Chem. 2008;54(12):e11-79.

肿瘤的早期诊断相关研究结果？ 乳腺癌和前列腺癌研究：小瘤子放任不管，不会带来什么问题——它们会自动停止生长或萎缩，甚至消失。 “早期诊断能提供某种好处。但问题是，这种好处远远没有像我们所希望的那么大，并且是用过度诊断和过度治疗的代价换来的。” Esserman L. Rethinking Screening for Breast Cancer and Prostate Cancer JAMA. 2009;302(15):1685-1692.

卵巢癌早期筛查研究结果 美国犹他大学的研究人员对7.8万多名年龄在55岁至74岁的女性进行调查，在被调查对象中，一半人定期接受常规妇科检查，另一半人接受早期卵巢癌筛查，其内容包括：连续6年每年接受一次血液检测，然后连续4年每年接受一次超声波检查。  研究人员对这两组人员进行了长达12年的跟踪调查。结果显示，在进行了卵巢癌早期筛查的女性中，共有212人罹患卵巢癌，其中118人死亡；没有进行早期筛查的女性中，有176人罹患卵巢癌，其中 100人死亡。从死亡率来看，两组没有显著差别。  分析还发现，在进行了卵巢癌早期筛查的女性中，有3285人的测试结果为假阳性，即无病而被误诊为有病。误诊导致1080人接受了包括卵巢切除在内的手术治疗，其中有15%因治疗产生了严重的并发症。  研究人员因此认为，用目前的方法，每年接受卵巢癌早期筛查不仅无助于及早发现病人，反而容易因为误诊而导致不必要的治疗措施，对身体造成伤害。要实现卵巢癌的准确早期筛查，需要开发出更好的技术。 Buys SS, et al. Effect of Screening on Ovarian Cancer Mortality: The Prostate, Lung, Colorectal and Ovarian (PLCO) Cancer Screening Randomized Controlled Trial. JAMA  2011;305(22):2295-2303.

肿瘤预测

目前可能吗？ 概念炒作？ 预测的意义？

2013年5月14日 - 茱莉在《纽约时报》上发表了“我的医疗选择”一文2013年5月15日 - 茱莉14日在《纽约时报》上发表了“我的医疗选择”一文她表示自己由于携带乳腺癌1号基因(BRCA1)，已经接受预防性的双侧乳腺切除手术，以降低罹癌风险。据茱莉介绍，自己的母亲曾经与癌症作斗争了近十年，于56岁时去世。由于妈妈给她遗传了BRCA1基因，因此患乳腺癌和卵巢癌的几率比较高，分别是87%和50%。……“在美国，BRCA1和BRCA2基因测试现在依然需要3000多美元，这对许多妇女仍然是一大阻碍。” ：

BRCA1和BRCA2 乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）和乳腺癌易感基因2（ breast cancer susceptibility gene2，BRCA2）是一类肿瘤抑癌基因。BRCA1基因位于17 q12-21区，基因组长约80kb, 编码区5711bp，共有24个外显子，编码一个具有1863 个氨基酸残基的蛋白质。BRCA2位于13q12-13区，基因组DNA 长约70kb，编码区为10987bp，共有27 个外显子，编码一个含有3418个氨基酸残基的蛋白蛋。 2013年6月13日美国最高法院裁定巨数遗传公司（Myriad Genetics）拥有的BRCA1和BRCA2基因专利无效。

BRCA1和BRCA2蛋白参与DNA损伤修复、转录活化与抑制、细胞周期的调节、中心体复制的负性调节、对肿瘤生长起负性调节作用、在维持基因组稳定性中起重要作用（Fig.）若BRCA1基因或 BRCA2基因发生突变，导致损伤的双链DNA不能得到修复，引起p53水平升高，继而p21升高，导致细胞凋亡和细胞周期停滞。如果是p53的基因修复失败，细胞过度增殖，从而导致肿瘤的发生。

BRCA1、BRCA2基因突变 BRCA1基因和BRCA2 基因可发生多形式、多位点基因突变。到目前为止， 已确定了600 多种BRCA1基因的种系突变，这些突变没有明显的突变热点，而是分布于整个编码区域。 BRCA1基因和BRCA2基因突变会导致家族遗传性乳癌及卵巢癌，占所有乳癌患者患者约10%。带有BRCA1或BRCA2基因突变的患者一生中罹患乳癌的机率为40%~87%，卵巢癌的机率为16%~60%。

“祖母效应”（Grandmother effect） 美国最新一项研究发现，乳腺癌基因BRCA1和BRCA2的突变将直接增加女性50%生育能力。随着生育率的增加，这些致癌基因出现在现代人口中的频率应该较高，但事实不是那样，相反频率相当低。 “祖母效应”（Grandmother effect） “在早前的研究中，研究人员发现绝经后的女性会出现’祖母效应’，即她们活的时间越长，就能够给予她们的女儿和孙辈更多的支持，从而允许更多的孙辈出生。而相反的情况是，女性绝经后因乳腺癌或卵巢癌等去世较早，不能帮助照顾她们的女儿和孙辈。这就影响了孙辈出生的数量，所以将突变基因传给下一代的机会也因此受到限制。” 然而，“祖母效应”不能完全否定生育能力增强是由乳腺癌基因导致的。 “在人类历史中，我们现在对工业和科技时代的改变相对迅速。在我们大多数的生存历史中，人类的角色都是狩猎收集者。在那个时期，女性的生育能力是受到限制的，这有可能对由这些基因导致的生育能力的增加形成了减弱作用。 美国University of Adelaide的da Silva博士说需要更多的研究来证明，现代狩猎社会可能会揭示这些基因突变在几代中扩散的方式及原因。 da Silva J. BRCA1/2 mutations, fertility and the grandmother Proc Biol Sci. 2012 Aug 7;279(1740):2926-9

《2013年美国国立癌症综合网络（NCCN）乳腺癌筛查与诊断临床实践指南》、《2013年美国国立癌症综合网络（NCCN）遗传性/家族性乳腺癌和卵巢癌高风险评估临床实践指南》中指出，通过检测BRCA1基因和BRCA2基因突变，能评价乳腺癌患病风险及采取预防措施，降低乳腺癌或卵巢癌的发病率。 一般来说，一级亲属（姐妹或母女）中有两位发生单侧乳腺癌或卵巢癌，其中一位在50岁以下，或有一位患上双侧乳腺癌，就可行BRCA1/2的基因检测，以了解有无基因突变携带，该基因的突变可能会导致本人患卵巢癌和乳腺癌的机会明显增高。

安吉丽娜·朱莉患乳癌和卵巢癌的几率比较高，分别是87%和50%， 这个比例从何而来？ 对于乳腺癌的发病风险除了BRCA1基因突变外，还存在很多因素，例如肥胖、生育、哺乳、精神压力、激素替代等。根据这些危险因素，而研发出很多乳腺癌发病风险评估模型，其中最著名的是美国的Gail模型。这次安吉丽娜·朱莉罹患乳腺癌和卵巢癌的几率可能就是通过类似的模型算出来的。 由于Gail模型的设计目前只是针对美国人或者白种人，那对于生活环境和生活习惯都不相同的黄种人中国女性和美国女性在人种、生活方式、乳腺癌发病率等方面存在很大差异，简单把该模型套在中国女性身上显然不妥。

BRCA1/BRCA2基因检测临床意义 手术风险评估:对携带BRCA1/BRCA2基因的人群，进行双侧乳腺癌风险降低乳房切除术（risk reduction mastectomy，RRM)，能至少降低乳腺癌发病风险的90%。进行双侧风险降低输卵管卵巢切除术（risk reduction salpingo-oophorectomy，RRSO），大约可以降低卵巢癌发病风险的80%。 化疗药物干预：对发生BRCA2基因突变的患者，给予他莫西芬预防性治疗，可以降低乳房癌发病风险的65%。 生育选择：如果夫妻双方都是BRCA1基因/BRCA2基因突变携带者，可以通过产前诊断、着床前胚胎遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis ，PGD）或辅助生殖，可以选择其子代是否携带突变的BRCA1基因/BRCA2基因，便于减低各种肿瘤的发生率。 指导健康管理：带有BRCA1基因/BRCA2基因突变但尚未发生乳癌的家族成员，在满25岁以后建议每六个月与进行乳房检查，每年接受乳房摄影甚至核磁共振扫描，以便早期发现乳腺癌。

联合检测

误区？ 肿瘤标志物因为缺乏器官特异性，用于肿瘤的临床诊断在特异性上通常都不高，同一肿瘤可出现多个肿瘤标志物，不同肿瘤亦可同时出现同一肿瘤标志物，因此，对某一特定肿瘤来说，检测一种肿瘤标志物，通常检测的临床诊断敏感性不高。 为提高肿瘤标志物的临床诊断敏感性，不断有人尝试将多种肿瘤标志物进行组合检测。 其实，这是一个误区，因为如果单个肿瘤标志物不具备特异和灵敏诊断肿瘤的价值，则也不可能出现理想的对某一肿瘤特异灵敏的联合应用模式。 Cordero OJ, et al. How the measurements of a few serum markers can be combined to enhance their clinical values in the management of cancer. Anticancer Res. 2008;28(4C):2333-2341.

联合检测的意义 肿瘤标志物因为其特异性不高，基本上只能用于肿瘤的疗效观察以及治疗和复发监测。 联合检测不应是出于肿瘤诊断的目的，而是在肿瘤患者治疗前，筛选能灵敏地指示疗效以及治疗和复发的标志物的方法。 但有些肿瘤标志的联合检测对特定肿瘤有意义，如AFP、HCG和乳酸脱氢酶可作为睾丸癌诊断/病例发现、疾病分期、预后、复发和治疗监测。AFP也可用于区分非精原和精原细胞肿瘤。

感染性疾病的筛查检测

几个例子 新华纵横]输血引来的纠纷_医药资讯_中国医药网.htm 只要住院就查艾滋 85岁老太质疑医院化验（图）.htm 八旬妇住院三天后染梅毒 家属怀疑输血感染_新闻中心_新浪网 吉林艾滋携带者“自愈” 缺证据病例尚存疑(图)-搜狐新闻 西安8名考生高考体检被误诊乙肝病毒携带者(图) 教师公招体检查出梅毒阳性 招考部门傲慢遭斥 -搜狐教育 贵州选调生头名疑“被梅毒”； 贵州省委组织部:经复查确认选调生头名患梅毒-搜狐健康

日常检验中假阳性的可能性有多大？ 假定一个抗-HIV ELISA试剂盒的敏感性和特异性均为99.9%，如果HIV人群感染率为1.0%，，则阳性预示值为91%，假阳性率小于10%，如果流行率为0.04%，则阳性预示值为28.4%，假阳性率大于71%。 有研究表明，我国献血人群中用第三代试剂筛查阳性率为0.2%(2439/1,195,286)，经确认阳性0.0009%(11/1,195,286)。因此，如按0.0009%的献血人群HIV感染流行率来计算，则假阳性率大于99%。 Liu P, et al. The false-positive and false-negative predictive value of HIV antibody test in the Chinese population. J Med Screen. 2008;15(2):72-75

假阳性结果的来源 标本 方法的局限性 操作误差

可能导致假阳性结果的标本因素 内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、溶菌酶、交叉反应物质存在等 外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全

CUT-OFF值设定的不确定性：“灰区”

怎样避免因“假阳性”结果报告带来的纠纷？ 建立传染病相关检验项目的“实验室检验程序” 如何实现“实验室检验程序”？

临床检测程序建立的一般原则

Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L. Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep. 2003 ;52(RR-3):1-13, 15; quiz CE1-4. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5203a1.htm 抗-HCV检测和结果报告程序

梅毒螺旋体感染的实验室检测程序A 筛查试验 确认试验 一种密螺旋体抗原血清学试验（如ELISA、TPPA/TPHA等） 另一种不同原理的密螺旋体抗原血清学试验（如ELISA、TPPA/TPHA等） 阳性反应 报告阳性 阴性反应 免疫印迹试验，少数情况可采用FTA-ABS 报告阴性 RPR/VDRL/TRUST 报告滴度,提示疾病活动性 检测密螺旋体IgM 提示疾病活动性 必要时 筛查试验 梅毒螺旋体感染的实验室检测程序A 确认试验 Patrick F, Mikhail G, Michel J, et al. 2008 European Guideline on the Management of Syphilis

抗HCV筛查及确认试验结果的解释 阴 性 阳性且S/CO 值高 阳性 筛查试验结 确认试验结 果 结果报告 解 释 不需检测 抗HCV阴性 解 释 阴 性 不需检测 抗HCV阴性 未感染HCV,除非怀疑是最近感染,或有其它证据表明有HCV感染 阳性且S/CO 值高 未检测 抗HCV阳性 提示既往或现症HCV感染. 未进行确认验.S/CO值高的标本一般均为确认阳性(≥95%),但尚有5%的标本可能为假阳性,可在患者要求下进行确认试验. 阳性 提示既往或现症HCV感染 阴性 不确定 抗HCV不确定 不能确定抗HCV及HCV感染状态,;应再采集另一份标本重测抗HCV(>1个月)或HCV RNA HCV RNA阳性 抗HCV 阳性 提示活动性HCV感染 RIBA 阳性 HCV RNA阴性 抗HCV阳性提示既往或现症HCV感染.单个HCV RNA阴性结果不能排除活动性感染 RIBA 阴性 抗HCV 阴性 未感染HCV RIBA 不确定 抗HCV 不确定 抗HCV筛查结果可能为假阳性,此时,提示未感染HCV Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L. Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep. 2003 ;52(RR-3):1-13, 15; quiz CE1-4.

定性免疫检验质量管理中试剂方法性能验证问题 病原体特异抗体的检测限？ 采用室间质评样本作为准确性评价？

质量控制 室内质量控制：为做质控而做质控？实质是什么？就是每批检测放一个室内质控品吗？ 室间质量评价： 政府法规规定？ 评审要求？ 自我教育？ 质量改进需要？

临床免疫检验展望 自动化 系统化 标准化 信息化（结果分析计算、报告和解释等）

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