遗传性疾病的分子诊断 ——诊断策略和工具 上海第二医科大学附属瑞金医院 樊绮诗

用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。1976年人们开始在实验室进行研究，1984年以来，基因检测在许多国家已成为常规项目，主要用于遗传性疾病的诊断。

一、遗传性疾病的分类 常染色体连锁遗传性疾病 ——致病基因位于常染色体 性染色体连锁遗传性疾病 ——致病基因位于性染色体

常染色体连锁遗传性疾病 常染色体隐性遗传——位于一对常染色体上的两个等位基因均发生突变才能产生临床症状，此时所导致的相应疾病即为常染色体连锁隐性遗传性疾病。 同一对染色体中只有一个等位基因发生突变的个体称为杂合子，二个等位基因均发生突变的个体称为纯合子。 囊性纤维变：常染色体连锁隐性遗传(7q31)

常染色体连锁显性遗传——位于一对常染色体上的二个等位基因之一发生突变即产生临床症状，所导致的相应疾病即为常染色体连锁显性遗传性疾病。 特点：家系中患者数目较多，大多情况下每一代均有患者。 Huntington舞蹈症：常染色体显性遗传(4p16.3)

性染色体连锁遗传性疾病 X染色体连锁遗传：大多为隐性 (如甲型血友病、杜氏肌营养不良症)，显性遗传非常罕见。 Y染色体连锁遗传

二、遗传性疾病中常见的分子异常 遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物——蛋白质（或酶）的表现异常所致。 基因突变主要包括三大类，即点突变、片段性突变和动态性突变。

（一）点突变 点突变：DNA分子中单个碱基的替换 终止密码子突变：点突变导致提前产生终止密码，或终止密码突变而编码一个氨基酸使肽链延长。 错义突变、无义突变、移码突变

各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变、蛋白质合成量下降、无蛋白质合成。

（二）片段性突变 核苷酸的丢失和增多 缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失 插入：外来基因片段插入某一基因序列中 倍增：基因内部某一段序列发生重复 基因重排：基因组中原来不在一起的基因 由于某些原因组合排列在一起。

（三）动态性突变 以三核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。 脆性X综合征：CGG重复 少年脊髓型共济失调：GAA重复 ……

三、遗传性疾病基因诊断的策略 （一）直接诊断策略 基因诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。 直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。

（二）间接诊断策略 间接诊断不是寻找 DNA 的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。 间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因。 间接诊断不是寻找 DNA 的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。

四、基因诊断所采用的技术

(一) 直接诊断所采用的技术 DNA片段性突变的检测 （1）Southern 印迹技术 将基因组DNA用限制性酶水解成无数片段经凝胶电泳后用碱处理使凝胶中的DNA变性为单链，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用标记探针与变性单链杂交，可使特异条带显影。

（2）多重PCR技术 在一个PCR反应体系中放入多对引物，当基因的外显子发生缺失时，根据条带缺失的数目和引物相应的位置，可判断基因中哪一个或哪几个扩增部位发生缺失。

2. 点突变 （1） 已知点突变的检测方法 a）PCR-RFLP

b）等位基因特异性寡核苷酸杂交 被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为15~20bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降 5~7.5℃，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。

C）PCR-ELISA 将PCR产物用ELISA方法加以检测的技术。在对目的基因扩增时，dNTP中同时混有用生物素标记的Bio-16-dUTP，使扩增产物带有生物素标记。若该产物能与突变点特异的寡核苷酸探针（3’端地高辛11-DIG-ddUTP标记）杂交，则该产物便带有地高辛标记信号，可利用与抗地高辛抗体共价结合的酶标检测系统进行显色反应，从而判断突变的存在。

d）寡核苷酸连接检测（oligonucleotide ligation assay，OLA） ——设计2个探针（探针A和B），探针A、B分别位于被检片段的5’和3’端，探针A的3’端与探针B的5’端紧邻，A探针的5’端和B探针的3’端分别用生物素和地高辛标记。设计引物时使突变位点位于A探针的3’末端处。被检标本经PCR反应后，使产物变性，同时与两个探针杂交，根据ELISA显色反应检测有无连接产物的形成即可知PCR产物中是否含有突变点。

e）DNA芯片技术（DNA chip） 在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果。

目前主要有2种类型：基片上就位合成寡核苷酸点阵芯片(ONA）和微量点样技术制作cDNA点阵芯片（CDA）。

（2）未知点突变的检测方法 a) 单链构象多态性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突变DNA的PCR产物经变性后产生两条与正常 DNA构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，从 而能区别正常与突变的DNA。SSCP只适用于检测 150~200bp长度的DNA片段。 不同顺序 不同构象 不同电泳行为

b) 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 利用不同序列的DNA分子具有不同的融点温度(Tm)的特性。设计引物时使被扩增的目的片段含有2个不同的区域，一个Tm较高，另一个较低，将该PCR产物在由变性剂形成的梯度凝胶上进行电泳，由于正常序列的PCR产物与突变的 PCR 产物的Tm不同，在电泳过程中Tm较低的区域被部分解链的先后不同，造成电泳迁移率的变化也不同，最后在凝胶中所处的电泳位置也不同，据此可以区别正常片段与突变片段。

c)异源双链分析 （heteroduplex analysis，HA） 正常DNA和突变DNA在一起变性后再缓慢复性，可使两者互补形成异源杂合双链，并在错配处形成一个凸起。在非变性凝胶电泳时，异源双链片段会产生与相应的同源双链片段不同的迁移率，从而使二者分开。

d) 熔点曲线分析(melting curve analysis） DNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的Tm较完全配对的同源双链的Tm低，在仪器上显示出不同的曲线从而将突变序列检测出来。所需仪器如高效液相色谱仪(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系统、LightCycler等。

e)双脱氧指纹图谱（dideoxy fingerprinting，ddF） 是将SSCP和Sanger双脱氧测序法结合起来的一种突变检测方法。将PCR产物纯化后用与 2 条双链各自互补的两个引物分别做sanger测序反应，但不同的是仅加入一种双脱氧核苷，反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据突变性质电泳图谱上会显示丢失或获得一条带或者至少有一条带的迁移率会发生改变。

f.DNA序列分析（DNA sequencing） Sanger测序技术： 以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2’，3’-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。

g)蛋白截短测试验 （protein truncation test，PTT） 从蛋白质水平检测由于碱基突变导致终止密码产生而使蛋白质合成提前终止产生截短的蛋白质。将正常人和病人的RNA逆转录成cDNA，并以cDNA作为模板进行PCR反应，扩增产物在体外经过转录，在无细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质。所合成的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时会出现比正常蛋白质截短的蛋白质。

3. 动态突变的检测 PCR技术 Southern印迹技术

4.基因表达异常的检测 定量PCR技术 1. DNA结合染料技术 2. 水解探针技术(又称TaqMan probe)技术 3. 杂交探针技术(又称荧光共振能量转移技术 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)

（二）间接诊断所采用的技术 1. 双等位基因多态性 限制性片段长度多态性（RFLP） 第一代DNA的遗传标记，具双等位基因（bi-allele）多态性，所含信息量有限。 检测方法：Southern印迹技术

2. 多等位基因多态性 小卫星序列 　　　又称串联重复可变数目（variable number tandem repeats，VNTR), 第二代DNA的遗传标记，以6 ~70bp为单位，可重复数次至数十次，以串联形式排列，构成数量可变的串联重复序列。等位基因常常达10 个以上，信息量比RFLP大得多。 检测方法：Southern印迹或PCR技术

微卫星序列 (microsatellite) 以2~6bp为单位，重复次数可达几十次，又称短串联重复序列(STR) 。在基因组中出现的数目和频率不同，分布广泛，具高度多态性。

3. 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP） 第三代DNA的遗传标记，其多态性仅表现为单个核苷酸的变异。在人类基因组中的数目可达300万个，是一种信息量非常大的标记系统。 　　检测方法：DNA芯片技术

1 2 8 7 C50: C49: C45: C44: Cjp: 11223 C50: C49: C45: C44: Cjp: 12212 21313 3 4 5 6 15 16 17 18 10 11 12 13 14 9 C50: C49: C45: C44: Cjp: 21121 21313 C50: C49: C45: C44: Cjp: 21121 21313 C50: C49: C45: C44: Cjp: 21121 12212 C50: C49: C45: C44: Cjp: 12212 C50: C49: C45: C44: Cjp: 21313 C50: C49: C45: C44: Cjp: 11223 12212 20 21 19 C50: C49: C45: C44: Cjp: 21313 C50: C49: C45: C44: Cjp: 21313 22 23

1 2 5.8 5.8 2.8 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 N N N 4.8 4.8 4.8 5 5 5 1 2 3 4 5.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 0.9 N N N N 4.8 4.8 4.8 4.8 5 5 5 5

1 2 4 3 5 6 5.8 2.8 4.8 4.8 1.2 0.9 inv N 5 5 7 8 9 10 11 2.84.80.9 - 5 5.8 4.8 1.2 inv 5 5.8 4.8 0.9 N 5 2.84.80.9 - 5 5.8 4.8 1.2 inv 5 5.8 4.8 0.9 N 5 12

（三）间接诊断的不确定性 遗传标记所带的信息性有限 新突变 基因重组 家系成员不够完整

五、基因检测的标本制备 DNA或RNA 　来自外周血、体液、分泌物和组织如毛发、皮肤、肌肉、器官、肿瘤组织等

产前基因诊断标本： 　羊水细胞（16~20周） 　绒毛膜细胞（8~12周） 非创伤性取样

六、遗传咨询和产前基因诊断 遗传咨询 明确诊断先证者，确定引起疾病的分子异常 了解本病传递至下代的风险率 判断胎儿是否患病

遗传咨询战略路线（以DMD为例） 男孩。分子生物学研究 是。或可能是。胎儿性别？ 是。孕妇是否携带者？ MD是否由Dystrophin缺陷所致 女孩。不进行分子生物学研究 不是。不进行产前基因诊断，但应研究家系中其他有风险者 不是。寻找引起本病的原因

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