DNA methylation 刘 丹 2010. 1.20

明星熊猫——“滚滚”

为什么熊猫是黑白的？ —— 基因决定命运

基因序列(Genotype)的改变可能导致功能及表型(Phenotype)的改变。 1942年，Conrad Hal Waddington 提出表观遗传学( Epigenetics)的概念，以此解释物种的内在基因与外观表现之间的关系。 基因序列(Genotype)的改变可能导致功能及表型(Phenotype)的改变。 基因型通过一些“偶然的、不确定的机制”决定了不同的表型。 —— 生物的不同特征完全随机获得

Waddington's epigenetics 基因型 表型

Waddington's epigenetics 基因型 表型

DNA双螺旋

基因的结构 真核生物的基因结构 基因表达受多种因素调控

概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型 —— 生物的不同特征由基因定向调控 现代表观遗传学 概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型 —— 生物的不同特征由基因定向调控 表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）： DNA甲基化 表观遗传学的核心（最初始的调控方式） 组蛋白修饰 MicroRNA Genomic imprinting

真核生物基因表达调控层次： 1、DNA水平调节 2、转录水平调节 3、转录后水平的调节 4、翻译水平调节 5、翻译后加工的调节 DNA 转录初产物RNA DNA甲基化 转录后水平的调节 核 细胞质 mRNA 翻译调节 mRNA降解的调节 蛋白质前体 mRNA降解物 翻译后加工的调节 活性蛋白质

DNA methylation的定义 DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

DNA methylation的定义 在甲基转移酶（DMNT）的催化下，DNA的CG两个核苷酸中的胞嘧啶（Cytosine）被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），这常见于基因的5‘-CG-3’序列 DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）

结构基因中广泛存在着相邻的两个CG，其中胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构（CpG）

CpG 岛（cpg island） 结构基因组中70%～ 90% 的独立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 岛 主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。 — 是结构基因启动子的核心序列和转录起始点

CPG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达 —— 基因表达的调控开关

DNA methylation的生物学功能 在发育和分化中调控基因的表达； 特征性表型基因的表达（肤色、毛发） X染色体的失活（X-inactivation ）

IAP: intracisternal A particle DNA甲基化生物学作用 IAP: intracisternal A particle 去甲基化：灰鼠基因（agouti）仅微量表达 甲基化：基因超量表达

X染色体的失活（X-inactivation ） 生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条X染色体其中一条失去活性的现象。 双倍的基因产物，保持和雄性动物 X染色体数量及功能上的一致性。

X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位。核心区命名位X染色体失活中心（X-chormosome inactivation center，Xic），其定位在人Xq13区（Barr氏小体浓缩部位）。 研究发现失活的染色体上DNA序列都呈高度甲基化，导致绝大多数基因转录处于关闭状态。

X-chromosome inactivation Copy Cat Allie Rainbow

影响DNA methylation的调控因素 DNA 甲基转移酶(DNMT)的活性 哺乳动物体内有三种DNA 甲基化转移酶：Dnmt1、Dnmt3a 和Dnmt3b。 DNMT1--- 持续性DNA 甲基转移酶；与甲基化相关，缺乏引起基因组低甲基化，染色体缺失、重排、突变畸形 DNMT3a、DNMT3b--- 从头甲基转移酶；与去甲基化相关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达

SCIENCE VOL 300 18 APRIL 2003

正常小鼠 (Dnmt1 +/+) —— 阳性对照 DNM1酶缺乏小鼠模型 (Dnmt1 chip/–) —— 实验组 Embryonic stem (ES) 细胞 (Dnmt1 –/–) —— 阴性对照

Dnmt1 chip/–小鼠Dnmt1酶的表达量明显减少，大约为正常小鼠的10%

Dnmt1 chip/–小鼠体重仅为正常小鼠66%

c-myc癌基因在Dnmt1 chip/–小鼠中异常高表达

影响DNA methylation的调控因素 组蛋白的甲基化 真核生物的组蛋白N 末端或C 末端氨基酸残基可生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等共价修饰，并影响基因转录。 H3K9 的甲基化与DNA 的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用 H3K4 的甲基化拮抗DNA 甲基化所产生的基因沉默

影响DNA methylation的调控因素 RNA 干扰 一般认为RNA 干扰( RNAi) 是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象 —— 翻译、转录后水平 siRNA 指导DNA 甲基化(RdDM) 现象证实：siRNA 可以通过DNA 甲基转移酶Dnmt1和Dnmt3b介导DNA 甲基化—— DNA水平

DNA methylation and Oncology

正常生物DNA甲基化 DNA甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞分化发育，基因组DNA经历了去甲基化、区域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性的去甲基化的过程。最后，这种DNA甲基化模式就相对稳定下来。

肿瘤组织的DNA甲基化 肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。 低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤 在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因发生高甲基化，导致基因沉默，对肿瘤抑制能力低下

进入细胞周期；凋亡缺失；DNA修复失效；血管生成；细胞黏附性减低；过度生长；不恰当的细胞表型表达；染色体不稳定；寄生序列表达

DNA甲基化与肿瘤的关系 肿瘤细胞的特征： 癌基因低甲基化 ——被激活； 抑癌基因高甲基化 ——被沉默 甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈晚

常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用 基因沉默对肿瘤的意义 肿瘤类型 APC 对细胞增殖、迁移、粘附、骨架重组及染色质稳定性失去调节作用 乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝癌 BRCA1 与DNA 修复与转录激活有关 乳腺癌、卵巢癌 CDKN2A/p16 周期素依赖性蛋白激酶抑制剂 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌 DAPK1 钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制 肺癌 E-cadherin 增强增殖、侵袭与转移 乳腺癌 、甲状腺癌、胃癌 ER 激素抵抗 乳腺癌、前列腺癌 GSTP1 失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用 前列腺癌、乳腺癌、肾癌 hMLH1 缺损DNA错配修复,基因点突变 结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌 MGMT p53-相关基因，与DNA 修复及耐药性有关 肺癌、脑瘤 P15 细胞的过度激活与增殖 非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌 RASSF1A 失去了对G1/S负调控抑制作用 肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、鼻咽癌 Rb 不能抑制DNA复制和细胞分裂必需的基因转录 成视网膜细胞瘤、少突神经胶质(细胞)瘤 VHL 错误的降解RNA结合蛋白质，改变RNA稳定性 肾细胞癌 缩写: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin-dependent kinase 2A; DAPK1, death-associated protein kinase 1; ER, estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase Pi 1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methyltransferase; RASSF1A, Ras association domain family member 1; Rb, retinoblastoma; VHL, von Hippel-Lindau; GIT, gastrointestinal tract; NHL, non-Hodgkin’s lymphoma.

有学者研究认为,DNA甲基化是继基因结构变异即突变和缺失之后的第3种抑癌基因失活机制。 CpG岛保护因子缺乏 DNMT3高表达和DNMT复合体调控障碍 复制周期时间错误 DNA甲基化导致遗传不稳定性。 Milutinovic S, DNA methyltransferase inhibition induces the transcription of the tumor suppressor p21(WAF1/CIP1/ sdi1) [J ]. J Biol Chem, 2000, 275 (9) : 6 353 - 6 359.

DNA methylation的应用前景 肿瘤的早期诊断 基因启动子区域的CpG岛甲基化能沉默基因转录，在正常细胞中是一种调节基因表达的手段。然而抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生而且一直进行的，导致恶性肿瘤表型的表达

DNA methylation的应用前景

DNA methylation的应用前景 Kuester 报道在88.19% ( 24 /27 ) 食管Barrett’s化生病例和100% (13 /13)的上皮内瘤变病例中检测到MGMT基因异常甲基化，提示MGMT甲基化是食管腺癌早期频繁发生的事件。 Kelavkar 等发现ALDX15基因在前列腺上皮内瘤变、前列腺癌中以异常甲基化存在；而在正常前列腺细胞系中是以非甲基化状态存在，说明其异常甲基化与前列腺癌的发生关系密切。 1.KUESTER D, et al. Silencing of MGMT expression by promoter hypermethylation in the metap lasia -dysp lasia - carcinoma sequence of Barrett’s esophagus. CancerLett, 2009, 275 (1) : 117 - 126. 2.KELAVKAR P, et al. DNA methylation paradigm shift: 15 - Lipoxygenase - 1 up regulation in p rostatic intraep ithelial neop lasia and p rostate cancer by atyp ical p romoter hypermethylation. Prostaglandins Other Lip id Mediat,2007, 82 (1 - 4) : 185 - 197.

DNA methylation的应用前景 优点：DNA甲基化检测具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。（血液、粘膜上皮标本） 缺点：特异性不足

DNA methylation的应用前景 肿瘤的预后分析 甲基化改变与肿瘤分级、分期有明显的相关性。 RASSF1A甲基化在低分化肺癌中比在高分化中更常见 在结直肠癌Dukes分期C和D 的病例中CDKN2A, p16 的甲基化率比A 和B 期的增高 DAS PM, DNA methylation and cancer. J ClinOncol, 2004, 22 (22) : 4 632 - 4 642

DNA methylation的应用前景 DNA异常甲基化可促进肿瘤的侵袭和转移 乳腺癌中Cyclin D2, RAR - β, Twist, RASSF1A和H IN - 1的甲基化改变与淋巴结、骨、脑、肺转移有关 MEHROTRA J, et al. Very high frequency of hypermethylated genes in breast cancermetastasis to the bone, brain, and lung . Clin Cancer Res, 2004, 10 ( 9 ) :3 104 - 3 109.

DNA methylation的应用前景 甲基化可作为肿瘤复发的独立预测因子。 口腔鳞状细胞癌时存在RECK基因甲基化的患者复发率明显增高 甲基化影响生存期 膀胱癌中APC, GSTP1和TIG1基因发生异常甲基化时,患者存活时间明显缩短 LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene p redicts poor p rognosis in oral squamous cell carcinomas[ J ]. Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058. ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cel - Free Serum DNA IndicatesWorse Outcome in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.

DNA methylation的应用前景 肿瘤的去甲基化治疗 DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3启动CpG核苷酸从头甲基化的保证，而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要水平（去甲基化） —— 抑制DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望

胞苷类似物通过共价键与DNMT形成不可逆的复合物从而竞争性抑制其活性,使DNA甲基化随细胞分裂进行性丢失,部分地逆转肿瘤的恶性表型。 5-Azacytidine 5-氮杂胞苷 5-aza-2‘-deoxycytidine 5-杂-2‘脱氧胞苷 Decitabine 4-氨基-1-(2-脱氧-β-D-赤式-顺-呋喃核糖)-1，3，5-三嗪-2(氢)-1 地西他滨

无基因特异性,不能选择性地活化沉默的目的基因，从而会引起整体的低甲基化; 优点：新型抗肿瘤药物 缺点： 无基因特异性,不能选择性地活化沉默的目的基因，从而会引起整体的低甲基化; 药物的活化作用可逆，疗效依赖于药物的持续存在; 大剂量应用时会对正常细胞有毒副作用 — 是否会诱发第二肿瘤？

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