DNA methylation 刘 丹 2010. 1.20
明星熊猫——“滚滚”
为什么熊猫是黑白的? —— 基因决定命运
基因序列(Genotype)的改变可能导致功能及表型(Phenotype)的改变。 1942年,Conrad Hal Waddington 提出表观遗传学( Epigenetics)的概念,以此解释物种的内在基因与外观表现之间的关系。 基因序列(Genotype)的改变可能导致功能及表型(Phenotype)的改变。 基因型通过一些“偶然的、不确定的机制”决定了不同的表型。 —— 生物的不同特征完全随机获得
Waddington's epigenetics 基因型 表型
Waddington's epigenetics 基因型 表型
DNA双螺旋
基因的结构 真核生物的基因结构 基因表达受多种因素调控
概念:基因的DNA序列不发生改变的情况下,基因的表达水平与功能发生改变,并产生可遗传的表型 —— 生物的不同特征由基因定向调控 现代表观遗传学 概念:基因的DNA序列不发生改变的情况下,基因的表达水平与功能发生改变,并产生可遗传的表型 —— 生物的不同特征由基因定向调控 表观遗传学的现象(基因表达的调控方式): DNA甲基化 表观遗传学的核心(最初始的调控方式) 组蛋白修饰 MicroRNA Genomic imprinting
真核生物基因表达调控层次: 1、DNA水平调节 2、转录水平调节 3、转录后水平的调节 4、翻译水平调节 5、翻译后加工的调节 DNA 转录初产物RNA DNA甲基化 转录后水平的调节 核 细胞质 mRNA 翻译调节 mRNA降解的调节 蛋白质前体 mRNA降解物 翻译后加工的调节 活性蛋白质
DNA methylation的定义 DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
DNA methylation的定义 在甲基转移酶(DMNT)的催化下,DNA的CG两个核苷酸中的胞嘧啶(Cytosine)被选择性地添加甲基,形成5-甲基胞嘧啶(5-mC),这常见于基因的5‘-CG-3’序列 DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)
结构基因中广泛存在着相邻的两个CG,其中胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构(CpG)
CpG 岛(cpg island) 结构基因组中70%~ 90% 的独立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 岛 主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域,约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。 — 是结构基因启动子的核心序列和转录起始点
CPG island的功能:通过甲基化与去甲基化,调控下游基因的表达 —— 基因表达的调控开关
DNA methylation的生物学功能 在发育和分化中调控基因的表达; 特征性表型基因的表达(肤色、毛发) X染色体的失活(X-inactivation )
IAP: intracisternal A particle DNA甲基化生物学作用 IAP: intracisternal A particle 去甲基化:灰鼠基因(agouti)仅微量表达 甲基化:基因超量表达
X染色体的失活(X-inactivation ) 生长发育过程中,雌性哺乳类动物细胞中的两条X染色体其中一条失去活性的现象。 双倍的基因产物,保持和雄性动物 X染色体数量及功能上的一致性。
X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位。核心区命名位X染色体失活中心(X-chormosome inactivation center,Xic),其定位在人Xq13区(Barr氏小体浓缩部位)。 研究发现失活的染色体上DNA序列都呈高度甲基化,导致绝大多数基因转录处于关闭状态。
X-chromosome inactivation Copy Cat Allie Rainbow
影响DNA methylation的调控因素 DNA 甲基转移酶(DNMT)的活性 哺乳动物体内有三种DNA 甲基化转移酶:Dnmt1、Dnmt3a 和Dnmt3b。 DNMT1--- 持续性DNA 甲基转移酶;与甲基化相关,缺乏引起基因组低甲基化,染色体缺失、重排、突变畸形 DNMT3a、DNMT3b--- 从头甲基转移酶;与去甲基化相关,在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达,缺乏引起胚胎死亡,在肿瘤组织中广泛高表达
SCIENCE VOL 300 18 APRIL 2003
正常小鼠 (Dnmt1 +/+) —— 阳性对照 DNM1酶缺乏小鼠模型 (Dnmt1 chip/–) —— 实验组 Embryonic stem (ES) 细胞 (Dnmt1 –/–) —— 阴性对照
Dnmt1 chip/–小鼠Dnmt1酶的表达量明显减少,大约为正常小鼠的10%
Dnmt1 chip/–小鼠体重仅为正常小鼠66%
c-myc癌基因在Dnmt1 chip/–小鼠中异常高表达
影响DNA methylation的调控因素 组蛋白的甲基化 真核生物的组蛋白N 末端或C 末端氨基酸残基可生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等共价修饰,并影响基因转录。 H3K9 的甲基化与DNA 的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用 H3K4 的甲基化拮抗DNA 甲基化所产生的基因沉默
影响DNA methylation的调控因素 RNA 干扰 一般认为RNA 干扰( RNAi) 是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象 —— 翻译、转录后水平 siRNA 指导DNA 甲基化(RdDM) 现象证实:siRNA 可以通过DNA 甲基转移酶Dnmt1和Dnmt3b介导DNA 甲基化—— DNA水平
DNA methylation and Oncology
正常生物DNA甲基化 DNA甲基化始发于胚胎早期,随着组织细胞分化发育,基因组DNA经历了去甲基化、区域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性的去甲基化的过程。最后,这种DNA甲基化模式就相对稳定下来。
肿瘤组织的DNA甲基化 肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变,其特点是总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。 低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化,基因印迹缺失以及染色体不稳定性增加,最终诱发肿瘤 在整体低甲基化的水平下,某些抑癌基因发生高甲基化,导致基因沉默,对肿瘤抑制能力低下
进入细胞周期;凋亡缺失;DNA修复失效;血管生成;细胞黏附性减低;过度生长;不恰当的细胞表型表达;染色体不稳定;寄生序列表达
DNA甲基化与肿瘤的关系 肿瘤细胞的特征: 癌基因低甲基化 ——被激活; 抑癌基因高甲基化 ——被沉默 甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关,DNA甲基化水平越低,染色体越容易发生功能异常,肿瘤的浸润能力就越高,临床分期也愈晚
常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用 基因沉默对肿瘤的意义 肿瘤类型 APC 对细胞增殖、迁移、粘附、骨架重组及染色质稳定性失去调节作用 乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝癌 BRCA1 与DNA 修复与转录激活有关 乳腺癌、卵巢癌 CDKN2A/p16 周期素依赖性蛋白激酶抑制剂 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌 DAPK1 钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制 肺癌 E-cadherin 增强增殖、侵袭与转移 乳腺癌 、甲状腺癌、胃癌 ER 激素抵抗 乳腺癌、前列腺癌 GSTP1 失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用 前列腺癌、乳腺癌、肾癌 hMLH1 缺损DNA错配修复,基因点突变 结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌 MGMT p53-相关基因,与DNA 修复及耐药性有关 肺癌、脑瘤 P15 细胞的过度激活与增殖 非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌 RASSF1A 失去了对G1/S负调控抑制作用 肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、鼻咽癌 Rb 不能抑制DNA复制和细胞分裂必需的基因转录 成视网膜细胞瘤、少突神经胶质(细胞)瘤 VHL 错误的降解RNA结合蛋白质,改变RNA稳定性 肾细胞癌 缩写: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin-dependent kinase 2A; DAPK1, death-associated protein kinase 1; ER, estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase Pi 1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methyltransferase; RASSF1A, Ras association domain family member 1; Rb, retinoblastoma; VHL, von Hippel-Lindau; GIT, gastrointestinal tract; NHL, non-Hodgkin’s lymphoma.
有学者研究认为,DNA甲基化是继基因结构变异即突变和缺失之后的第3种抑癌基因失活机制。 CpG岛保护因子缺乏 DNMT3高表达和DNMT复合体调控障碍 复制周期时间错误 DNA甲基化导致遗传不稳定性。 Milutinovic S, DNA methyltransferase inhibition induces the transcription of the tumor suppressor p21(WAF1/CIP1/ sdi1) [J ]. J Biol Chem, 2000, 275 (9) : 6 353 - 6 359.
DNA methylation的应用前景 肿瘤的早期诊断 基因启动子区域的CpG岛甲基化能沉默基因转录,在正常细胞中是一种调节基因表达的手段。然而抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生而且一直进行的,导致恶性肿瘤表型的表达
DNA methylation的应用前景
DNA methylation的应用前景 Kuester 报道在88.19% ( 24 /27 ) 食管Barrett’s化生病例和100% (13 /13)的上皮内瘤变病例中检测到MGMT基因异常甲基化,提示MGMT甲基化是食管腺癌早期频繁发生的事件。 Kelavkar 等发现ALDX15基因在前列腺上皮内瘤变、前列腺癌中以异常甲基化存在;而在正常前列腺细胞系中是以非甲基化状态存在,说明其异常甲基化与前列腺癌的发生关系密切。 1.KUESTER D, et al. Silencing of MGMT expression by promoter hypermethylation in the metap lasia -dysp lasia - carcinoma sequence of Barrett’s esophagus. CancerLett, 2009, 275 (1) : 117 - 126. 2.KELAVKAR P, et al. DNA methylation paradigm shift: 15 - Lipoxygenase - 1 up regulation in p rostatic intraep ithelial neop lasia and p rostate cancer by atyp ical p romoter hypermethylation. Prostaglandins Other Lip id Mediat,2007, 82 (1 - 4) : 185 - 197.
DNA methylation的应用前景 优点:DNA甲基化检测具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。(血液、粘膜上皮标本) 缺点:特异性不足
DNA methylation的应用前景 肿瘤的预后分析 甲基化改变与肿瘤分级、分期有明显的相关性。 RASSF1A甲基化在低分化肺癌中比在高分化中更常见 在结直肠癌Dukes分期C和D 的病例中CDKN2A, p16 的甲基化率比A 和B 期的增高 DAS PM, DNA methylation and cancer. J ClinOncol, 2004, 22 (22) : 4 632 - 4 642
DNA methylation的应用前景 DNA异常甲基化可促进肿瘤的侵袭和转移 乳腺癌中Cyclin D2, RAR - β, Twist, RASSF1A和H IN - 1的甲基化改变与淋巴结、骨、脑、肺转移有关 MEHROTRA J, et al. Very high frequency of hypermethylated genes in breast cancermetastasis to the bone, brain, and lung . Clin Cancer Res, 2004, 10 ( 9 ) :3 104 - 3 109.
DNA methylation的应用前景 甲基化可作为肿瘤复发的独立预测因子。 口腔鳞状细胞癌时存在RECK基因甲基化的患者复发率明显增高 甲基化影响生存期 膀胱癌中APC, GSTP1和TIG1基因发生异常甲基化时,患者存活时间明显缩短 LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene p redicts poor p rognosis in oral squamous cell carcinomas[ J ]. Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058. ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cel - Free Serum DNA IndicatesWorse Outcome in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.
DNA methylation的应用前景 肿瘤的去甲基化治疗 DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用, DNMT1是DNMT3启动CpG核苷酸从头甲基化的保证,而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要水平(去甲基化) —— 抑制DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望
胞苷类似物通过共价键与DNMT形成不可逆的复合物从而竞争性抑制其活性,使DNA甲基化随细胞分裂进行性丢失,部分地逆转肿瘤的恶性表型。 5-Azacytidine 5-氮杂胞苷 5-aza-2‘-deoxycytidine 5-杂-2‘脱氧胞苷 Decitabine 4-氨基-1-(2-脱氧-β-D-赤式-顺-呋喃核糖)-1,3,5-三嗪-2(氢)-1 地西他滨
无基因特异性,不能选择性地活化沉默的目的基因,从而会引起整体的低甲基化; 优点:新型抗肿瘤药物 缺点: 无基因特异性,不能选择性地活化沉默的目的基因,从而会引起整体的低甲基化; 药物的活化作用可逆,疗效依赖于药物的持续存在; 大剂量应用时会对正常细胞有毒副作用 — 是否会诱发第二肿瘤?
Thank You !