实 验 七 微生物的分离、培养和菌种保藏

微生物的分离、培养和菌种保藏 目的要求 实验材料 试验程序 思考题

目的要求 初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏的基本方法。 练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。

实验材料 样品：新鲜土壤。 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基（10mL装）。 无菌水：带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、台天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、胶水、水浴锅。 试剂：5000U/mL链霉素液 0.5％重铬酸钾液

实 验 程 序 微生物的分离 微生物的接种方法（示范） 微生物培养中的氧气条件 微生物的菌种保藏方法 四大类微生物菌落形态的比较和识别

实验程序1 （微生物的分离） 用稀释平板法（又名混菌法）从土壤中分离真菌。 用平板涂抹法分离土壤中的放线菌（土壤稀释液制备同上）。 实验程序1 （微生物的分离） 用稀释平板法（又名混菌法）从土壤中分离真菌。 用平板涂抹法分离土壤中的放线菌（土壤稀释液制备同上）。 用平板划线法分离土壤中的细菌（土壤稀释液的制备同上）。

实验程序2 （微生物的分离—稀释平板法） 制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范） 1. 称取土壤5g，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－1的土壤悬液。 2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。取已稀释成10－1的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10－2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－4 10－5 10－6土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底，稀释方法见图-1。

实验程序3 （微生物的分离—稀释平板法） 图－1 土壤稀释液的制备和稀释液的取样

实验程序4 （微生物的分离—稀释平板法） 涂平板：每组取培养皿2付，即每个同学做一只。 1.先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 2.另取一吸管，以无菌操作法吸取10－4或10－5土壤稀释液1mL，加在无菌培养皿的一边，在皿的另一边加入2滴5000U/mL的链霉素液。此时两液严防相混。 3.取已熔化的在水浴锅中保温500C左右的马铃薯蔗糖培养基2管，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、链霉素液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于28～300C恒温培养5～6d。观察真菌菌落形态以及计数菌落。并计算出每g土壤中真菌的数量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。 挑取单个菌落，接种到斜面培养基上作纯化和性能测定，若不纯，需要继续分离。

实验程序5 （微生物的分离—稀释平板法）

实验程序6 （微生物的分离—平板涂抹法） 每组取无菌培养皿2付（每个同学做一只）。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 实验程序6 （微生物的分离—平板涂抹法） 每组取无菌培养皿2付（每个同学做一只）。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 以无菌操作法先在培养皿中加入0.5％重铬酸钾溶液2滴，取已熔化的淀粉琼脂培养基2管，分别倒入培养皿，使培养基与重铬酸钾充分混匀，铺平，制成平板。 凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀释液 0.2mL放在平板上。 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于28～300C条件下培养6～7d，观察放线菌菌落形态及计数菌落，并计算出每g土壤中放线菌的数量（方法同上）。 挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，至最后得到纯培养为止。

实验程序7 （微生物的分离—平板涂抹法）

实验程序8 （微生物的分离—平板划线法） 每组取无菌培养皿2付，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。 实验程序8 （微生物的分离—平板划线法） 每组取无菌培养皿2付，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。 凝固后，用接种环取相应的 菌液一环（10－5或10－6）在平板上划线（教师作示范）。 1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线（图－5）。完毕后，倒置于28～300C温室培养。 2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线（见图－5）。划线完毕，盖上皿盖，倒置于28～300C温室培养。 挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。

实验程序9 （微生物的分离—平板划线法）

实验程序10 （微生物的接种方法） 接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。 实验程序10 （微生物的接种方法） 接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等（见图－6）。 图－6

试验程序11 （微生物的接种方法—斜面接种法） 试验程序11 （微生物的接种方法—斜面接种法）

实验程序12 （微生物的接种方法—斜面接种法） 实验程序12 （微生物的接种方法—斜面接种法） 左手平托两支试管，拇指按住试管底部。外侧使是菌种试管，内侧是待接的空白斜面。（两支试管的斜面同时向上），右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。 右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌心将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。 将已灼烧过的接种环伸入外侧的菌种试管内。先冷却，而后再用环沾取一定量的菌苔，将沾有菌苔的接种环抽出试管。

实验程序13 （微生物的接种方法—斜面接种法） 实验程序13 （微生物的接种方法—斜面接种法） 迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部，轻轻向上划线（直线或曲线）。 接好种的斜面试管口再次过火焰，棉塞底部过火焰后立即塞入试管内。 将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼，使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，使菌体爆溅，造成污染。 放下环后，再将棉塞旋紧，在试管斜面上距试管口2～3cm处贴上标签。 28～370C恒温培养。

实验程序14 （微生物的接种方法—液体接种和穿刺接种） 实验程序14 （微生物的接种方法—液体接种和穿刺接种） 液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要求无菌操作。 穿刺接种法：用接种针经火焰灭菌后，沾取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后沿着原接种线将针拔出，要做到手稳、动作轻巧迅速，最后塞上棉塞。再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。

实验程序15 （微生物的接种方法—液体接种和穿刺接种） 实验程序15 （微生物的接种方法—液体接种和穿刺接种）

实验程序16 （微生物培养中的氧气条件） 参观培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵——摇床、厌氧培养罐等。 实验程序16 （微生物培养中的氧气条件） 参观培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵——摇床、厌氧培养罐等。 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。 厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。厌氧培养罐（图－9），以某种气体取代培养容器中空气，并添加还原剂，如产气袋法和换气法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用的如葡萄糖——美兰指示剂。

实验程序17 （微生物培养中的氧气条件－厌氧培养） 实验程序17 （微生物培养中的氧气条件－厌氧培养） 美兰氧化还原指示剂：0.006N NaOH 0.015% 美兰溶液 6％ 葡萄糖溶液 上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅速放入厌氧罐中。

实验程序18 （微生物培养中的氧气条件－厌氧培养） 实验程序18 （微生物培养中的氧气条件－厌氧培养）

实验程序19 （微生物培养中的氧气条件－厌氧培养） 实验程序19 （微生物培养中的氧气条件－厌氧培养） 生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。 化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用吸水紙包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。 物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。

实验程序20 （微生物的菌种保藏方法） 菌种保藏是微生物学工作中的重要一环，微生物菌种保藏的目的要求达到以下三点： 1.保持原种形状,延缓或防止退化。 2.保持活力而不死。 3.保证纯培养，防止污染。 微生物菌种保藏的关键是使微生物代谢作用缓慢，处于休眠状态。为此，要求降低其体内酶的活性。一般采用低温、干燥和缺氧条件来实现。 菌种保藏的方法有: 冰箱斜面保藏、石蜡封藏法、砂土管保藏法、冷冻低温干燥法和液氮保藏法等。

实验程序21 （微生物的菌种保藏方法） 斜面冰箱保藏法：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3个月至半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验室均采用。 缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。 石蜡封藏法：在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线菌。 石蜡的处理：250mL三角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3高压灭菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸发掉。

实验程序22 （微生物的菌种保藏方法） 砂土管保藏法：(可用于保藏产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的细菌）。 1.砂土管的制备：取河沙若干，用40目过筛，出去大颗粒，加10％HCl后煮沸30min，除去有机质（也可用10％HCl浸泡2—4h)。最后倒去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取0.3m以下非耕作层的瘦黄土若干，晒干磨细，过120目筛。 2.按 土：砂＝1：4 的比例均匀混合，装入指形管中，以1cm高为宜，塞上棉塞，160～1700C干热灭菌2h。 3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右的无菌水，用无菌接种环制成菌悬液，用无菌吸管吸取0.2～0.3mL的菌悬液放入每个砂土管中，用接种环拌匀，并贴上标签，注明菌名。 4.菌液加好后，立即进行抽真空干燥，要求在24h内抽干，尤其是夏天要求较短时间内抽干。摇散砂土，放干燥器内冰箱保藏。

实验程序23 （微生物的菌种保藏方法） 冷冻真空干燥保藏法：此法一般常用于细菌或病毒一类的菌种保藏，常用脱脂牛奶或血清作为菌种的保护剂。 实验程序23 （微生物的菌种保藏方法） 冷冻真空干燥保藏法：此法一般常用于细菌或病毒一类的菌种保藏，常用脱脂牛奶或血清作为菌种的保护剂。 1. 脱脂牛奶的制法：将牛奶加热到800C左右，然后冷却，除去表面的一层脂肪。这样反复2—3次后用脱脂棉花过滤，并在3000r/min的离心15min，再除去表面脂肪。将脱脂牛奶装入三角瓶中，用0.5kg/cm2高压灭菌30min，连续2次，并作无菌试验。 2. 用无菌的脱脂牛奶将新鲜斜面菌种制成牛奶菌种悬液，无菌操作装入安瓿管中（装量不超过其体积的1/3)。 3. 预冻：将分装好的安瓿管在－25～－400C之间的干冰酒精中进行预冻，1h后即可抽气进行真空干燥。 4.真空干燥：预冻后放入真空干燥箱中，开启真空泵进行干燥。 5.封管前将安瓿管装入多歧管上，开启真空泵，当真空度达到0.01mm汞柱后用火焰熔封。 6.做好的安瓿管放入冰箱中保藏。

实验程序24 （四大类微生物菌落形态的比较和识别） 实验程序24 （四大类微生物菌落形态的比较和识别） 区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面的观察。 菌落形态： 菌落表面湿润：细菌——薄而小，酵母菌——厚而大。 菌落表面干燥：放线菌——密而小，霉菌——松而大。 细胞形态： 细菌——小而分散 酵母菌——大而分散 放线菌——丝状细 霉菌——丝状粗

实验程序25 （四大类微生物菌落形态的比较和识别） 实验程序25 （四大类微生物菌落形态的比较和识别） 表－1

思 考 题 什么叫无菌操作？分离放线菌和真菌为什么需要分别加重铬酸钾和链霉素？ 平板培养时为什么要把培养皿倒置？ 好氧培养和厌氧培养的原理和方法有何异同？ 试述菌种斜面冰箱保藏、石蜡封藏和砂土管保藏等方法的原理。

实 验 七 结 束