第三节 生产菌种的保藏 1、菌种保藏的目的 保证其生产性能稳定，不污染杂菌，不死亡。

2、菌种保藏原理 菌种保藏的方法很多，原理也大同小异。首先 要挑选典型菌种的优良纯种。最好采用它们的休眠 体(如分生孢子、芽孢等)；其次，还要创造一个最 有利休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避 光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。

3、影响菌种存活及长期保藏的主要因素 （1） 培养条件和菌龄 （2） 菌种悬液的浓度 （3） 保护剂 （4） 冻结速度 （5） 干燥程度 （6） 保藏条件 （7） 恢复培养

不同菌种保藏方法比较 保藏方法 适用范围 保存有效时间 斜面室温 各类微生物(除病毒外) 细菌、酵母1个月；霉菌、放线菌2-3个月 斜面冰箱 （4度） 细菌、酵母3个月；霉菌、放线菌6个月 矿 油 酵母、霉菌、放线菌 低温1年以上 砂土管 芽孢杆菌、产孢子霉菌、放线菌 低温1-数年 冷冻干燥 各类微生物 低温1-20年 固体曲 产大量孢子的霉菌

冷冻干燥保藏法和液氮保藏法

3、常用的菌种保藏方法 1 、斜面或穿刺保存法 2、液体石蜡封存保藏法 4℃冰箱或15℃室温，保存期3-6个月 适用于细菌、酵母和霉菌. 斜面培养基用液体石蜡密封，4℃冰箱1年，适于不能利用液体石蜡的菌种。

过筛、灭菌并干燥的沙土为保藏介质，接种，真空干燥、密封，4℃冰箱保存，1-3年保存期。 3、固体曲保藏法 用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体，后加以保存。直接密封或真空干燥后于4℃冰箱1－3年以上保存期。 适用于产孢子的真菌。 4、沙土管保藏 过筛、灭菌并干燥的沙土为保藏介质，接种，真空干燥、密封，4℃冰箱保存，1-3年保存期。 适用于霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌的保藏。

5、超低温液氮保藏法 6、冷冻干燥保存 将要保藏的菌种置于10％的甘油或二甲亚砜保护剂中，密封于 安瓿瓶内； 将菌液降至0 ℃ ，再以每分钟降低1 ℃的速度降至－35 ℃ ，然 后将安瓿瓶置于液氮罐的气相中保存。 适用于所有菌种，保存10年左右。 6、冷冻干燥保存 通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。 冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。

4、国内外重要菌种保藏机构 1、ATCC (American Type Culture Collection) 美国标准菌种收藏所， 马里兰州，罗克维尔市 2、CSH (Cold Spring Harbor Laboratory) 冷泉港研究室， 美国 3、IAM (Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo) 日本东京大学应用微生物研究所， 日本东京 4、IFO (Institute for Fermentation, Osaka) 发酵研究所，日本大阪

5、普通微生物菌种保藏管理中心 （CCGMC ） 中科院微生物所，北京 6、工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC) 轻工部食品发酵工业科学研究所，北京 7、医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 中国医学科学院皮肤病研究所，南京 中国药品生物制品检定所，北京。 中国预防医学科学院病毒学研究所，北京

8、中国抗生素菌种保藏管理中心（CACC） 中国医学科学院医药生物技术研究所，北京； 四川抗生素工业研究所，成都； 华北制药集团抗生素研究所，石家庄。 9、兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC） 中国兽医药品监察所，北京。 10、林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC） 中国林业科学研究院，北京。 11、中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） 武汉大学 ， 武汉。

5、菌种的衰退与复壮（rejuvenation） 菌种衰退（degeneration）是指菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。

（一）菌种衰退的具体表现 1）、菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为衰退。 2）、生长速度缓慢，产孢子越来越小。 3）、代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。 4）、致病菌对宿主侵染能力下降。 5）、对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力的下降等。 总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过 程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优 势。

（二）菌种衰退的原因 1)、基因突变 2)、连续传代 3)、不适宜的培养和保藏条件

菌种的复壮 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。

复壮措施方法 纯种分离 淘汰衰退的个体 选择合适的培养条件

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。 1）、纯种分离法 通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。 “菌落纯”的水平——稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。 “细胞纯”即“菌株纯”的水平——培养皿或凹玻片等作分离室的方法、显微操纵器的纯种分离法。

将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。例如： 2)、淘汰法 将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。例如： 有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。

3)、选择合适的培养条件 相同培养基与不同培养基的培养。 培养基的营养。