Molecular biology for ecologists

DNA DNA：细胞核、线粒体、叶绿体 nrDNA mtDNA cpDNA 核酸 RNA：细胞质

nrDNA 核酸 核苷酸 磷酸 核苷 戊糖 碱基

nrDNA T C

nrDNA T C A G Q：对于GC含量高的DNA模板，在PCR过程中，需要注意什么？

nrDNA DNA的一级结构 4种核苷酸的连接及其排列顺序 表示了DNA分子的化学构成

nrDNA DNA的二级结构 2条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构

nrDNA DNA的二级结构

nrDNA DNA的三级结构 DNA分子通过扭曲和折叠形成的特定构象       

nrDNA DNA的四级结构 DNA与蛋白质复合物的结构

nrDNA Q：电泳检测PCR产物分子量大小时，为什么要先进行PCR产物的变性？

DNA的性质 水解性：糖苷键，磷酸二酯键 酸碱性：磷酸基，碱基 紫外吸收：碱基 变性与复性：双螺旋结构

水解 酸解性 对酸最不稳定的是嘌呤和脱氧核糖之间的糖苷键 碱水解 DNA无2’-OH，不能形成碱水解的中间产物，对碱有一定抗性 酶水解

水解 酶解性 磷酸二酯酶：非特异性水解 核酸酶：专一水解 核酸内切酶 核酸外切酶

限制性内切酶 1. 具有较高的专一性。能识别DNA分子中上特有的碱基顺序，并在特有的位点上切割。其识别顺序大多具有回文结构，回文结构也称反向重复序列。

限制性内切酶 1. 具有较高的专一性。能识别DNA分子中上特有的碱基顺序，并在特有的位点上切割。其识别顺序大多具有回文结构，回文结构也称反向重复序列。 2. 大多数限制性内切酶对两条DNA链进行交错切割，所以切割后形成末端为单链的互补顺序，即粘性末端。

限制性内切酶

限制性内切酶的命名 EcoRI 材料属名的第一个字母 该材料中已分离出的该类酶的编号 材料种名的头两个字母 所用菌株

限制性外切酶

DNA的性质 水解性：糖苷键，磷酸二酯键 酸碱性：磷酸基，碱基 紫外吸收：碱基 变性与复性：双螺旋结构

DNA的酸碱性 当pH > pI时， =N+H－上的H+解离下来 核苷酸带负电 凝胶电泳分离核酸

DNA的凝胶电泳 迁移率 分子大小 与分子量对数成反比 胶浓度 与胶浓度成反比 DNA构象 超螺旋 > 线性 > 开环 分子大小 与分子量对数成反比 胶浓度 与胶浓度成反比 DNA构象 超螺旋 > 线性 > 开环 电流 与电流大小成正比 5V/cm 碱基组成 影响不大

紫外吸收性质 核酸的最大吸收值在260nm附近

蛋白质的最大吸收值在280nm附近

DNA纯度的检测 = 2.0 纯RNA 1.8 - 2.0 DNA纯度高 A260/A280 < 1.8 有蛋白

DNA浓度的检测 A260 = 1 等价于 50 μg/mL 双螺旋DNA 40 μg/mL 单链DNA或RNA

DNA的性质 水解性：糖苷键，磷酸二酯键 酸碱性：磷酸基，碱基 紫外吸收：碱基 变性与复性：双螺旋结构

DNA的变性与复性 DNA变性： 指双螺旋区的氢键断裂，形成单链无规则线团的过程。

DNA的热变性 DNA热变性 爆发式 发生在很窄的温度范围内

DNA的热变性 DNA的熔点 Tm 加热变性使DNA双螺旋结构失去一半时的温度 82 - 95℃

Tm与GC含量

Tm与介质离子强度 ∝ Tm 介质离子强度 DNA制品不应保存在极稀的电解质溶液之中，在含盐缓冲液中保存较为稳定

DNA的复性

DNA的复性 变性DNA 缓慢冷却，DNA复性 退火 2. 骤然冷却，不能复性 DNA电泳前的变性 核酸杂交：Southern杂交

DNA的复制

中心法则 转录 mRNA 翻译 蛋白质 DNA RNA （病毒） 复制 反转录

DNA的复制： 以亲代DNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA的过程。

DNA的半保留复制 模板：亲代DNA双链 碱基互补 新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的

DNA的半不连续复制 以5’ →3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。

DNA的半不连续复制 DNA复制需要引物启动

DNA链的延伸 DNA聚合酶Ш催化 底物:四种5’-脱氧核苷三磷酸 在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。

DNA链的延伸 DNA链的延伸 冈崎片段怎么连接？ DNA连接酶 RNA引物怎么办？ 5’ 3’核酸外切酶 碱基错配怎么办？ 5’ 3’核酸外切酶 碱基错配怎么办？ 3’ 5’核酸外切酶

DNA复制体系 模板：母链DNA 引物：一小段RNA 原料：dNTP 酶和蛋白质因子：DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA外切酶

DNA复制对分子生态学研究的意义 引物 可以根据研究需要设计相应的引物 扩增特定的片段 游离的3’-OH 双脱氧测序法 可以根据研究需要设计相应的引物 扩增特定的片段 游离的3’-OH 当3’-OH脱氧时，DNA链不能延伸 双脱氧测序法

PCR Polymerase chain reaction Mullis 1993 诺贝尔化学奖

模板

模板

dNTP，引物，Taq聚合酶

dNTP ATP

dNTP ——双脱氧测序 双脱氧测序：dNTP和ddNTP的混合物

引物

Taq聚合酶

Taq聚合酶 来源：水生栖热菌（Thermus aquaticus） 特点： 酶活性 70℃, > 60bp/second 　热稳定性 95℃, 40min, 50%活性 　外切酶活性 5’ 3’核酸外切酶活性 　作用环境　偏碱性　Tris-HCl

Q：PCR过程中如何保证PCR产 物的忠实性？

Mg2+ Taq聚合酶是Mg2+依赖性的 Mg2+浓度能改变酶的催化活性和产物 浓度过高，非特异性扩增 浓度过低，聚合酶活力显著下降

热变性

引物退火

引物退火 退火温度 温度越高，结合特异性增加，效率降低 温度越低，结合特异性降低，效率增加 　 温度梯度 　 Touchdown

链延伸

链延伸 PPi

链延伸

１次循环

PCR产物的检测 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳