精品课程 项目三 培养基的配制 咸宁职业技术学院

培养基的配制 培养基的成分 一 培养器皿的清洗 二 三 培养基母液的配制 4 培养基的制作与灭菌 四 5

一、培养基的成分 植物激素 无机盐 有机物 培养体支持材料 辅助物质 水 分 培养基的成分

1、无 机 盐 大量元素 （≥0.5mmol/L ） 微量元素 元素名称 添加形式 N KNO3,NH4NO3 P KH2PO4 、NaH2PO4 K KCl 、KNO3 Ca CaCl2 ·2H2O Mg Mg2SO4 · 7H2O S 微量元素 （≤ 0.5mmol/L） Fe FeNa2-EDTA Zn Zn SO4 B H3BO3 Mn MnSO4 Cu CuSO4 Mo Na2MoO4 · 2H2O Cl

2、有 机 物 碳水化合物：提供碳源和调节渗透压，主要是蔗糖。 维生素：以各种辅酶的形成参与多种代谢活动，对生长，分化等有很好的促进作用，常用的有 VB1和VB6。 天然复合物：促进某些愈伤组织和器官的生长，有椰子汁、香蕉泥、苹果汁等。 肌醇：促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成，对组织细胞繁殖、分化有促进作用。 氨基酸：是蛋白质的组成成分，为有机氮源，可直接被细胞吸收利用，培养基中常用的是甘氨酸。

3、植物激素 （1）生长素类 种类：NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲 哚丁酸)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸) 作用：促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根。 浓度：0.05－5mg/L

3、植物激素 （2）赤霉素（GAs）　 种类：GA3 作用：主要用于诱导离体芽的萌发和伸长。 注意：不耐热。

3、植物激素 （3）细胞分裂素（CTK） 种类： KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、 ZT(玉米素)、2ip(异戊烯氨基嘌呤) 作用：促进细胞分裂，诱导芽的形成和丛 芽产生. 浓度：0.05－10.0mg/L

3、植物激素 （4）脱落酸（ABA）：其作用与赤霉素相反,能促进芽和种子进入休眠状态,促进短日照的植物提前开花. （5）乙烯： 乙烯对组织培养物的影响： 组培中植物组织会释放少量乙烯，对培养物的生长、胚的发生和芽的分化有抑制作用. 克服方法：1.降低培养基中蔗糖的浓度或用葡萄糖、麦芽糖代替蔗糖；2.在培养基中加入5-15mg/L的硝酸银也能控制乙烯的形成。

4、培养体支持材料 琼脂 用量：6－10g/L 种类：琼脂粉 琼脂条 作用：固化作用 其它　 玻璃纤维、滤纸桥、海绵等。

5、辅助性物质 抗生素：防止外植体内生菌造成的污染。 抗氧化物：防止氧化。 活性炭：吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质；抑制外植体褐变；防止玻璃苗的产生；促进培养物生长和分化；促进生根。

培 养 基 类 型 基本培养基 完全培养基 初代培养基 继代培养基 诱导培养基 增殖和生根培养基 固体培养基 液体培养基 按营养水平 培 养 基 类 型 按营养水平 完全培养基 按培养阶段 初代培养基 继代培养基 按培养进程 诱导培养基 增殖和生根培养基 按态相 固体培养基 液体培养基

基本培养基种类 基本 培养基 SH培养基 N6培养基 MS Miller B5培养基 White

MS培养基 无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐 营养丰富 不需要添加更多的有机附加物

Miller培养基 无机元素用量是MS的1/3－1/2 微量种类少 无肌醇

White培养基 无机盐浓度较低 使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果

B5培养基 含较低的铵，硝酸盐和盐酸硫胺素用量较高。 适合双子叶植物， 尤其木本植物组培。

SH培养基 特点与B5相似，硫酸铵改用磷酸二氢铵。 无机盐浓度较高

N6培养基 成分简单 硝酸钾和硫酸铵含量高 适合花粉、花药培养

二、培养器皿的清洗 1、洗涤场所及用具： 场所：洗涤室 用品：水池、塑料盆、塑料桶、下水用过滤网，各种规格刷子。 2、洗涤液： 洗衣粉 洗洁精 高锰酸钾 稀盐酸 重铬酸钾+浓硫酸混合液 3、洗涤标准： 透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。

4、清洗方法 新购置 培养器皿 1%稀HCl浸泡12h 已用过的培养器皿 污染瓶 清 水冲 洗 洗洁精洗涤 晾干/烘干备用 4-5次 新购置 培养器皿 1%稀HCl浸泡12h 清 水冲 洗 4-5次 已用过的培养器皿 洗洁精洗涤 晾干/烘干备用 高 压 灭 菌 污染瓶

三、培养基母液配制 （一）母液备制流程： 确定培养基 计算 称量 准备工作 分装 定容 溶解 贴标签 保存

（二）母液配制方法 1、营养成分的配制 根据药品性质将母液配制成以下四类： （1）大量元素 可以混在一起配制成10—20倍液，注意离子之间沉淀，如Ca2+和S042-，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生沉淀，一定要分别单独配制充分溶解再放入母液中。

1、营养成分的配制 （2）微量元素 可配成100—200倍混合母液。 （3）铁盐 硫酸亚铁和EDTA钠盐易沉淀，需单独配制，配成100—200倍鳌合剂不易沉淀。 （4）有机化合物 维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或200倍液，也可分别配制。

2、植物生长调节物质的配制 植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱，浓度一般为0.5－1mg/ml。 IAA、IBA、GA等先溶于少量的95％的酒精中，再加水定容。 NAA可先溶于热水或少量95％的酒精中，再加水定容。 2，4-D可用少量0.1mol/L的NaOH溶解后，再加水定容。

2、植物生长调节物质的配制 3、药品用量的计算 KT和BA先溶于少量0.1mol/L的HCI中再加水定容。 玉米素先溶于少量95％的酒精中，再加热水到一定浓度。 3、药品用量的计算 配制母液时药品用量(mg)=配方用量(mg)×浓缩倍数×制备容量（L）

（三）配制时注意事项 1、配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。 2、药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。 3、将配制好的母液分别贴好标签，存放在低温冰箱内备用，用时再按比例稀释。

ＭＳ培养基母液的配制 化 合 物 名 称 原配方量 mg 扩大 倍数 称取量 母液体积 (ml) 配制1升培养基应移取量(ml) 母液名称 名 称 原配方量 mg 扩大 倍数 称取量 母液体积 (ml) 配制1升培养基应移取量(ml) 母液名称 ＮＨ4ＮＯ3 1650 10 16500 1000 100 大量元素母液 ＫＮＯ3 1900 19000 CaCl·2H2O 440 4400 MgSO4 ·7H2O 370 3700 KH2PO4 170 1700 MnSO4·H2O 22.3 2230 微量元素母液 ZnSO4·7H2O 8.6 860 CoCl·6H2O 0.025 2.5 CuSO4·5H2O 0.02 25 H3BO3 6.2 620 Na2MO4·2H2O 0.25 KI 0.83 83 FeSO4·7H2O 28.7 2870 铁盐 母液 Na2-EDTA 37.3 3730 烟酸(Vpp) 0.5 50 500 有机物母液 盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素 0.1 5 肌醇 5000 甘氨酸 2

四、培养基制作与灭菌 流 程 量取母液 培养基熬制 定 容 确定配方 称取蔗糖、琼脂 调PH值 接 种 灭　菌 封 口 分 装

（一）培养基制作流程 1、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出，混合。母液取用量的计算。 制备培养基时母液取用量（ml）=1000÷浓缩倍数×制备培养基数量（L） 2、适量蒸馏水放入加热容器，蒸馏水应少于所制培养基数量，约终体积的2/3-3/4，接通电源加热。 3、向加热容器中加入称量好的琼脂。搅拌加热，至完全溶化。

（一）培养基制作流程 4、琼脂熬化后，称取相应量的蔗糖，加入加热容器中至溶解。 5、将母液混合液加入到加热容器中，搅拌混匀。 6、蒸馏水定容至所需体积。 7、测试培养基溶液的PH值，过高滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整，调成pH值5.8左右。 8、迅速分装到培养瓶中，封口灭菌备用。

（二）培养基灭菌 培养基分装封口后立刻进行灭菌，至少在24h内完成灭菌程序。 一般采用的是高压湿热灭菌，要求压力0.105MPa（温度121℃）时,保持15-20分钟。 某些激素、维生素采用过滤灭菌。

（三）培养基的保存 防尘：防治灰尘污染。 避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。 恒温：4 ℃可保存3－6周，室温下两周内用完。 定期更新：不易长期保存。