原生质体培养方法 液体浅层培养 固体平板培养 固-液体双层培养 琼脂糖珠培养

液体浅层培养:Liquid thin layer culture 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物 缺点：原生质体分布不均匀，常发生原生质体粘连现象而影响其进一步生长和发育；难以跟踪观察某一个细胞的发育情况；一旦污染，全皿报废

固体平板培养:Solid culture 固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低融点琼脂糖可在30C左右融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养 优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率 缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀

液体－固体双层培养:Liquid solid culture 即在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面 优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成 缺点：不易观察细胞的发育过程

Semi-permeable membrane on solid medium

Semi-permeable membrane enhances embryo regeneration in citrus protoplast culture

琼脂糖珠培养:Agarose bead culture 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50l一滴的量滴于直径6 cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养(Thompson等，1986)。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成

原生质体发育与植株再生 细胞壁再生 细胞分裂与生长 愈伤组织形成 植株再生

1. 细胞壁再生 原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整细胞壁 新合成的细胞壁可用0.1％荧光增白剂（Calcofluor）染色后在荧光显微镜下观察，可见到绿色荧光围绕细胞表面，证明细胞壁已形成。也可用高渗溶液产生质壁分离的方法、电子显微镜观察技术和冰冻蚀刻法等进行再生细胞壁的研究 原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，之后在质膜与片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁 只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂阶段

2. 细胞分裂和生长 原生质体培养数天后，胞质增加，细胞器增殖，RNA、蛋白质及多聚糖合成增加，不久即可发生核的有丝分裂及胞质分裂 原生质体一般培养2～7 d开始第1次分裂，但第1次分裂的时间随植物种类、分离原生质体的材料、原生质体质量、培养基成分和培养条件而异 用幼苗下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、未成熟种子的子叶等分离原生质体，一般比用叶肉分离原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快

3. 愈伤组织形成 1）多数情况下，原生质体培养2周后，可形成多细胞团，3周后形成肉眼可见的小细胞团，5-6周后形成直径1 mm的小愈伤组织

4.植株再生 原生质体培养再生的愈伤组织可直接转移到分化培养基，一步成苗（器官发生）。愈伤组织也可通过体细胞胚发生，先形成胚状体，再诱导生芽、生根。不同植物种属，其再生方式不同

仙客来原生质体的再生

香蕉原生质体再生—Assani等2006 看护培养

Sugarbeet （糖甜菜）callus and protoplast regeneration

影响原生质体培养的主要因素   基因型 番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析表明，其愈伤组织再生能力受2个显性基因决定(Koornneef等1987)。Cheng和Veilleux(1991)对芙薯(S. phureja)原生质体培养能力进行遗传分析，证明从原生质体培养到形成愈伤组织受2个独立位点的显性基因控制(Cheng等1991) Dudits等（1991）以苜蓿不同基因型深入研究，表明某个基因型在离体培养时难以形成体细胞胚。若将对激素调节有作用的发根农杆菌rolB和rolC基因引入并表达，可能促使其体细胞胚形成

原生质体来源 供体材料类型：向日葵幼叶、子叶和下胚轴原生质体培养，只有下胚轴原生质体培养得到了细胞团和体细胞胚，而幼叶和子叶原生质体均未获得成功 供体细胞的分化程度：同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，其生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以提高原生质体的细胞分裂频率和再生能力，并且可提高实验重复性 柑橘：叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生，只有胚性愈伤组织来源的原生质体才能再生

起始培养密度与培养基 起始培养密度：适宜密度为1-5×105/ml 培养基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生   起始培养密度与培养基 起始培养密度：适宜密度为1-5×105/ml 培养基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生 培养基营养成分完全性：越丰富越好

Protoplast density counting 25格 × 16格（0.1 mm3）的血球计数板计算公式：原生质体细胞数 / ml = 80小格（左上、右上、左下、右下、中5个中格）内原生质体细胞个数/80 × 400 × 104 × 稀释倍数 1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3

三、原生质体再生植株遗传及变异 染色体变异 植株性状变异

染色体变异 染色体倍性变异是原生质体再生植株的常见变异类型 原生质体再生植株的倍性与分离原生质体的起始材料有关 由茎尖、叶肉和胚性组织细胞分离的原生质体能较好保持原来的倍性 用悬浮培养细胞，特别是长期继代培养的细胞系分离的原生质体，较易出现染色体倍性及数目的变化 Grosser等（1984）报道，由三叶草叶肉原生质体再生的植株为二倍体（2n=16），而由培养细胞分离的原生质体再生的植株为四倍体（2n=32） 原生质体再生植株变异还与植物种类有关：马铃薯易变，柑橘不易变

植株表型变异与育种 原生质体再生植株表型变异：包括植物学性状、抗性变异、育性/果实无核、成熟期等 变异程度的大小与起始材料及培养过程中产生的变异有关 原生质体再生植株变异可为体细胞遗传学研究和品种改良提供有益的材料 从原生质体培养再生植株已选育一些新品种（体细胞突变育种）