“分解尿素的微生物的分离 与计数”

是在实践必修3中“培养液中酵母菌种群数量的变化”及“土壤微生物的分解作用”两个探究课题的基础上进行的有助于加强学生探究实验技能的课题研究

学生需要在本专题课题1中获取有关微生物实验室培养的相关知识，并在实践操作中进行锻炼，进而对微生物培养中的无菌操作、制作平板、微生物接种等有一定的认识与理解的前提下才可开展的实验

该实验操作体现的突出特点是： 1 土壤浸出液的稀释问题 初次实验一般土壤浸出液的稀释倍数为103～107 ，我校绿地土壤稀释为105 。

2 有关选择培养基的应用 选择培养基培养出的的细菌还需进一步的筛选处理和必要的鉴定过程

3 有关固培养基上细菌的计数问题 学生在必修3“培养液中酵母菌种群数量的变化”这一探究实验中已经了解利用计数板计数菌液中菌体数量的方法，在此基础上让学生理解固体培养基上菌落计数法。 年

由于在具体的实验操作中遇到几个问题，我们可以把该专题的内容调整为以实验设计为主，让学生自由选择其中感兴趣的某些实验阶段进行操作体验的形式

实验设计之一 探究课题：尿素的分解是否与土壤溶液有关 实验假设：尿素的分解与土壤溶液有关（尿素的分解与土壤溶液无关） 根据所提出的假设帮助学生确定实验原理并组织学生以小组为单位完成实验过程。 实验原理：硝酸(HNO3)与尿素的反应生成CO（NH2）2.HNO3白色沉淀，可以以此来检测尿素是否被分解。

实验过程 ：（1）土壤取样，在校园绿地或近郊选择肥沃、湿润的土壤进行取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的容器中。 （2）取10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，静止一会儿，吸取上清液，作为备用的土壤浸出液。（此时，教师提示学生增加一份将上清夜煮沸处理后冷却的土壤浸出液另作备用。） （3）取三支相同的无菌试管，分别编号为A、B、C，在试管A中加入10毫升土壤浸出液，在试管B中加入10毫升煮沸冷却后的土壤溶液，C中加入10毫升蒸馏水，分别在A.B.C试管中加入2克尿素，再用透气的棉塞把三支试管口塞住，并把其放在28℃-30℃的环境中，两周后利用50%的硝酸(HNO3) 测定尿素含量。

实验结果及分析：加入浓度为50%的硝酸(HNO3) 4毫升，试管A中无沉淀，表明无尿素；试管B、试管C中沉淀很多，表明尿素还存在。A和C对照说明尿素的分解与土壤溶液有关，A和B对照说明，加热煮沸过的土壤溶液则失去了分解尿素的能力。 实验结论：尿素的分解与土壤溶液有关 .

实验设计之二 探究课题：土壤中是否存在分解尿素的微生物 实验假设：土壤中存在分解尿素的微生物（土壤中不存在分解尿素的微生物） 根据假设组织学生参考教材，明确实验原理 实验原理：将所取土样制成土壤溶液，接种到仅以尿素作为提供氮源的选择培养基上进行培养（其他养分齐备），这样不能分解尿素的微生物因缺少氮源而不能生长，只有分解尿素的微生物才能正常生长繁殖。用此法将分解尿素的微生物分离出来。

实验过程： (1)制备培养基 准备牛肉膏蛋白胨培养基、选择培养基和鉴别培养基。初次实验一般土壤浸出液的稀释倍数为103～107。依据平行重复原则，每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，总共需要15个选择培养基，在培养皿上分别标上A_1—A_3、B_1—B_3……E_1—E_3，5个牛肉膏蛋白胨培养基，在培养皿上分别标上A、B、C、D、E，经高温高压灭菌后制作成平板。此外，另制作5个加入酚红的鉴别培养基，装入试管分别标上P_1—P_5，经高温高压灭菌后搁置斜面。

(2)微生物的培养与观察  将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，对应放入已备好的无菌试管中，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。依照浓度从低到高的顺序涂布平板，不需要更换移液管。将涂布好的培养皿放在28℃-30℃温度下培养3—4天。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。提倡学生在做记录前自行设计记录表格。

结果与分析：在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，说明选择培养基起到了选择作用。但选择出来的微生物能不能分解尿素这还需要下一步来鉴别。

(3)鉴别用选择培养基选择的微生物对尿素的分解 取含酚红的培养基P_1—P_5，挑选选择培养基中不同形态的菌落接入P_1—P_4的斜面上，P_5不接种，作为空白对照，将P_1—P_5放在28℃～30℃的温度下培养3～4天，观察培养基的颜色变化。 阶段结果与分析：P_1—P_4的酚红培养基呈红色，是土壤中的微生物分解尿素释放NH3，结果PH上升的。P_5呈淡红色说明尿素没有被分解。

实验结论：氮源由尿素提供的选择培养基能把土壤中分解尿素的微生物分离出来。用鉴别培养基鉴别了分离出来的微生物能分解尿素。所以，土壤中确实存在着分解尿素的微生物。

 在本课题的实践过程中,教师必须对每个要开展的实验环节和理论依据了如指掌。同时还要提前通过个人的实际操作预见到学生在实验过程中可能出现的问题，对于怎样引导学生开展设计型实验，需要教师有反复实践的经历，并结合本学校实验的设备、条件的不同作适当的调整；另外，这个阶段的实验需要较长的操作时间，从提出方案到实验准备再到具体实验最后看出结果需要大约一周多的时间，这在课程安排上会有很大困难，最好是将学生分工协作，安排课上和课下两部分，课上为讨论制定方案，完成实验设计；课下学生自由选择阶段体验。