实验2 分离以尿素为氮 源的微生物

任务1：怎么从土壤中分离出能分解尿素并将其作为氮源的微生物呢？ 利用以尿素为唯一氮源 的培养基进行筛选。

…… 举一反三 （1）将土壤中的固氮菌分离出来 （2）将土壤中自养微生物分离出来 （3）筛选出抗青霉素的微生物 （4）筛选出耐高浓度食盐的微生物 ……

配制培养基 选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制和阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 尿素培养基25ml 葡萄糖 0.025g NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g 水 15ml 尿素 10ml 琼脂是未被纯化的混合物,内含一定量的含氮化合物 琼脂糖不含氮元素，但有固化作用。 物理性质（形态）上是固体培养基 功能上是选择培养基

配制培养基 尿素培养基25ml 葡萄糖 0.025g 琼脂是未被纯化的混合物,内含一定量的含氮化合物 NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g 水 15ml 尿素 10ml 琼脂糖 0.5g 琼脂是未被纯化的混合物,内含一定量的含氮化合物 琼脂糖不含氮元素，但有固化作用。

1、通过什么方法可以判断细菌确实能将尿素分解成氨。 思考： 1、通过什么方法可以判断细菌确实能将尿素分解成氨。 尿素培养基 葡萄糖 0.025g NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g 琼脂糖 0.5g 酚红 0.25g 尿素 10ml 水 15ml 方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,接种培养该细菌，若指示剂变红，说明该种菌能将尿素分解成氨。

利用以尿素为唯一氮源 的培养基进行筛选。 任务1：怎么从土壤中分离出它们呢？ 细菌 尿素 NH3 中性 碱性 酚红颜色： 黄色 红色 中性 碱性 酚红颜色： 黄色 红色 利用以尿素为唯一氮源 的培养基进行筛选。 (变色范围 pH6.4-8.2) 任务1：怎么从土壤中分离出它们呢？

思考： 2、要验证以尿素为唯一氮源的培养基 对土壤中的细菌确实具有选择作用，你 该如何设计实验。

配制培养基 实验组 对照组 选择培养基 尿素培养基 LB培养基 蛋白胨： 0.25g NaCl 0.12g 酵母粉： 0.12g K2HPO4 0.12g 琼脂糖 0.5g 酚红 0.25g 尿素 10ml 选择培养基

二、实验目的: 使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶) 通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pH的变化(脲酶催化的化学反应) 统计被检测的土壤中含有的以尿素为氮源的微生物的数量

三、实验中涉及到的一些问题： （一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多？（选材的问题） 没硬化，腐殖质丰富的土壤 （二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？ 碳源、尿素、无机盐、水、酚红 （三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物对尿素分解能力的高低？ 培养基红色的深浅和区域的大小 （四）统计微生物的数量可用哪些方法？ 稀释涂布平板法，显微镜直接计数法

三、实验中涉及到的一些问题： （五）用稀释涂布平板法计数时，菌落数在30-300计数。 做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度 （六）实验设计要遵循的原则： 重复性原则 对照原则 （排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度）

过滤灭菌后的尿素

（二）制备细菌悬液 制备成10-2、10-3、10-4、10-5 土壤稀释液

配制菌悬液 得10-2, 10-3, 10-4的菌悬液 1g土壤 1个99ml无菌水 2个4.5ml无菌水

倒平板 需要倒3个LB平板，9个尿素平板 LB(对照) 尿素 10-3 10-4 10-5 每个稀释度 1个LB对照平板 3个尿素平板(平行重复组)

接种 取0.1ml菌悬液

涂布分离

涂布分离

37℃倒置培养 按浓度捆成一摞 恒温37℃培养

10-4 、 10-3,、 10-2

利用血球计数板的缺点: 不能区分死菌与活菌 不适于对运动的细菌计数 需要相对高的细菌浓度 个体小的细菌在显微镜底下难以观察

练习题 特定 1、选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 抑制 阻止 1、选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 抑制 阻止 2、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有 直接计数。 稀释度 细菌 30-300 显微镜 3、在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 平均数

D A 4、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中．得到以下几种统计结果，正确的是 B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233 D 5.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因可能有( ) ①由于土样不同 ②由于培养基污染 ③由于操作失误 ④没有设置对照 A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④ A