新的里程碑： TALEN靶向基因敲除 北京康为世纪生物技术有限公司

北京康为世纪生物科技有限公司 王春香 博士 执行董事兼总经理 北京大学生物系学士和硕士学位  北京大学生物系学士和硕士学位 美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）病理系博士学位。 1999年回国 2002年创办北京天为时代科技有限公司 2005年被QIAGEN收购 - 天根 2007年底创建康为世纪 目标：成为中国的Invitrogen

北京康为世纪生物科技有限公司 康为世纪生物科技有限公司 北京大学、清华大学、 复旦大学 中国科学院、军事医学 科学院 实验设计平台 我们的客户 我们的合作伙伴 北京大学、清华大学、 复旦大学 中国科学院、军事医学 科学院 301医院、协和医院、 上海瑞金医院 华大基因、诺华制药 完善的产品线 一站式服务平台 实验设计平台 分子生物学平台 蛋白表达与纯化 平台 抗体制备纯化平台 免疫学检测平台 分子生物学 全系列产品 蛋白生物学产品 免疫学相关产品

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崭新的技术解决经典的挑战 崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 - 基因敲除（Knockout） 什么是基因敲除 - 通过某种方法将一个特定的目标基因破坏，使其失去原有的功能。 为什么要做基因敲除 - 基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一。 寻找、证明一个基因的功能都需要哪些步骤？

科霍法则 （Koch‘s postulates ） 科研论证基本法则 科霍法则 （Koch‘s postulates ） 如何证明某种微生物导致了某种疾病？ 该种微生物存在与患病个体而不存在于健康个体。 该种微生物可从患病个体上分离出来并体外培养。 当把该种微生物接种入健康个体体内时可使健康个体患病。 从人为接种的患病个体中又可分离得到该种微生物。 Robert Koch 1843 – 1910

科研论证基本法则 Reverse genetics Falkow的分子科霍法则（Falkow’s molecular Koch‘s postulates） 如何证明一个基因编码一种毒力因子？ 该基因存在于毒力菌株，而不存在于无毒菌株。 当该基因被敲除时菌株毒力消失或下降。 当该基因被补回（敲除）突变菌株时毒力得到恢复。 Reverse genetics

为什么要做基因敲除？ 基因敲除是证明基因功能不可缺少的逻辑环节 基因敲除是基因工程和基因治疗的重要手段

怎样做基因敲除？ 经典方法 ：自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！ 革命性的进步：RNAi – 临时性，不完全敲除 – Knockdown 饱含希望与失望的技术：ZFN 新的里程碑：TALEN

TALEN技术原理 基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，其本质是一个转录调控因子，主要有两个重要的结构域：特异性识别靶核酸序列的靶点识别域，切断DNA序列的核酸酶功能结构域。 靶点识别结构域的组成 17 -18个34aa重复序列 34aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基 靶向敲除

TALEN发展过程 1989年，植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.）avrBs3 基 因被克隆。 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 - TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译

TALEN的最前沿 2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 一篇综述 《Move over ZFN》

TALEN基因敲除基本流程 确定靶点：选择目标基因外显子中相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点 4. 将重组真核表达质粒转入（卵）细胞 5. 筛选突变体

构建TAL靶点识别域 RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确 TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD） RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确 欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14 -18个）串联克隆即可。

具专利保护的克隆构建系统

具专利保护的克隆构建系统 步骤一：靶点识别单元串联

具专利保护的克隆构建系统 步骤二：TALEN表达质粒构建

真核表达TALEN质粒对 X 2 将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。 X 2

FOKI 内切酶打断靶点区 步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除 TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。

突变体形成 内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。

突变体筛选 利用实验设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，可进行PCR产物酶切鉴定以筛选发生目标基因敲除的突变个体。当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测

TALEN介导的同源重组 HR 同源重组发生率升高几个数量级 Donor plasmid

锌指蛋白核酸酶（ZFN） 基因敲除 约30aa模块，在锌离子帮助下形成“ββα”结构。其中构成alpha螺旋的6aa可特异识别3连碱基 不是任意三连碱基组合都有对应模块 – 靶点选择受限 ‘上下文效应’（context effect）- 模块单元对3连碱基的识别特异性受相邻模块影响 - 模块串联构建方法基本不实用 通常用3 – 4个模块构成靶点识别域 Off-targeting现象严重

ZFN off-targeting 原因

怎样做TALEN 基本工具质粒 1单元模块质粒：A，G，C, T共4种 2单元模块质粒：4X4=16种 TALEN表达载体：2种 14 – 18bp靶点序列

怎样做TALEN T A L E N 定 制 质 粒 产 品 1单元模块质粒 A, G, C, T 4种选择 2单元模块质粒 共16种选择 pCS2 TALEN真核表达载体 TALEN空载体2种/套 1+2单元模块质粒套装 4+16+2共22种质粒/套 多单元模块质粒 20以下任意单元数目 pCS2 TALEN真核表达质粒 将指定TALEN模块插入pCS2 TALEN真核表达载体

怎样做TALEN T A L E N 技 术 服 务 TALEN质粒构建 提供两个测序证明的14碱基TALEN识别域真核表达克隆(pCS2)。且以293T细胞系转染，PCR酶切鉴定，灰度扫描定量证实突变效率高于10% TALEN靶向敲除细胞系构建 提供经克隆测序证明的（至少单等位基因）移码突变细胞系 TALEN靶向敲除斑马鱼构建 提供（至少）单等位基因移码突变F1斑马鱼

TALE技术应用展望 靶向基因表达调控 靶向基因敲除- NHEJ 靶向基因敲入-HR 基因治疗 例如：chemokine receptor 5（CCR5）基因

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