微生物控制检测 Mrs Robyn Isaacson Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物检测 目的 回顾环境控制和质量控制的微生物检测 微生物环境监测 容器完整性测试 灭菌前微生物负载测试 培养基灌装促生长试验 无菌测试 其他微生物实验室事项 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

环境监测 微生物限度值 表3 必须建立微生物污染的水平（限度），这样就可以起到警戒、纠偏的目的，并监控整个工厂的空气质量趋势。 这些数据是平均值 单个沉降碟在空气中暴露小于4小时 这些数据是指导性的，并不是代表标准 必须建立微生物污染的水平（限度），这样就可以起到警戒、纠偏的目的，并监控整个工厂的空气质量趋势。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

环境监测 方法 表面监测 擦拭法和接触碟法都可以使用 应当对产品接触表面、地面、墙以及设备进行定期监测 接触碟 – 用于平整表面 取样面积25cm2 培养基要凸起，高于碟子边缘 培养基中含有中和剂 表面擦试法-用于非规则表面 擦拭面积大约为25cm2 定性或定量 表面取样必须遵循无菌取样操作 （使污染生产过程的关键表面的风险最小化） 擦拭法和接触碟法都可以使用 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

环境监测 方法 浮游菌监测 沉降菌监测 撞击式，离心式和膜过滤（明胶）取样仪 必须取一定体积的空气（取样体积必须有代表性） 仪器必须经过校验 沉降碟在空气中的暴露时间为30-60 分钟（时间过长可能导致琼脂干掉），在灌装过程中需要更换。 只能给出定性和半定量的数据 数据必须结合空气浮游菌的取样结果进行评价 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

环境监测 取样地点 必须基于微生物污染的风险 取样点必须在产品或组件暴露的区域周围取样，比如： 低级别的区域以较低频率进行监测并监控趋势 在灌装针头处 冻干机产品装载处 胶塞锅 部件无菌连接操作部位 操作人员活动频繁处（但不会影响生产进程） 低级别的区域以较低频率进行监测并监控趋势 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

环境监测 人员 每次进入，手套都必须取样（但不能在消毒过后马上取样） 定期的对着装的其他部位进行取样 洁净室的操作人员必须定期的验证来表明自己在更衣时衣服未受污染（更衣资质确认）。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

环境监测 污染水平与趋势 GMP法规上的限度值仅供参考。 企业必须根据不同的区域制定警戒和纠偏限度值。 必须考虑单个结果值 -- 平均值可能掩盖了不可接受的情况 必须要有书面的操作规程规定数据回顾和超过限度所采取的行动 趋势分析报告 对于人员和环境的短期和长期结果分析报告 环境监测结果必须归档在批生产记录里 微生物菌群的明显改变必须引起重视。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

环境监测 消毒剂 消毒剂的适用性、有效性、局限性以及消毒规程程都必须评估 必须制定最少接触时间 对于A/B级区的消毒剂必须是无菌级别的，包装在无菌容器内，并在明确的效期内使用 必须证明对工厂内的常规菌群有效 必须使用杀孢子剂（如果在环境中发现孢子），可以“喷雾”的形式消毒部件和设备 消毒的操作规程必须足够的详尽，以确保重现性 配制，工作顺序，接触时间 从不良趋势中检出的微生物必须检测它们对于日常使用消毒剂的耐受性。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

环境监测 制药用水 制药用水的微生物水平是非常重要 必须要有一个广泛且全面的水系统监测方案 工厂源水，预处理水，反渗透水，去离子水，纯化水/超纯水和注射用水都必须被监测 企业必须设定警戒和纠偏限度。 WHO推荐（下一页） 对于纯化/水超纯水和注射用水，药典的限度如下： 纯化水<100CFU/mL 超纯水和注射用水10CFU/100mL（但通常高温循环） Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

制药用水微生物限度参考值 （CFU/mL） 环境监测 制药用水微生物限度参考值 （CFU/mL） Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

环境监测 制药用水 压缩空气/氮气/CO2 如果条件允许，需检测大肠菌群及或假单胞菌群（该菌群可能会导致生物膜的产生）。 非肠道用药制剂用水必须检测热原。 限度必须小于0.25 EU/mL 水的微生物检测用R2A 琼脂（此种培养基对于水中的微生物的复活提供低养分）在30-35°C 至少培养5天。 取样程序必须遵循生产过程中的操作规程。 压缩空气/氮气/CO2 必须监测非活性粒子和微生物。 取样时使用减压口以提供稳定的气流，验证时必须考虑这些要求 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

容器完整性测试 密闭系统的完整性 初始验证用无菌培养基注入容器中，然后将容器浸入106 CFU/mL的高浓度菌悬液中。 对真空下进行密封的容器必须定期进行真空度检测，以证明在整个有效期内仍能维持真空度。 建立规程，在制造过程剔除密闭性不好的产品。 进行灯检的操作人员必须经常休息，并且定期进行视力检查。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物负载/过程控制IPC检测 对于灭菌前的生物负载测试，过程控制和原材料的测试都必须建立相应的书面规程 必须对测试方法进行验证，来证明少量微生物也能够复活。 如果环境中有厌氧菌存在，就要考虑使用厌氧培养基。 必须有文件来规定微生物限度的目标值，警戒和纠偏值，并且文件中应规定超过纠偏值时，所必须采取的措施。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物促生长试验 用于微生物检测的培养基必须先对其进行营养试验来证明它是可以支持微生物的生长 培养基灌装验证用的培养基必须能够支持大多数微生物的生长（细菌和真菌）。 通常选用大豆酪蛋白酶消化培养基。有时如果环境中存在厌氧菌，需要考虑使用厌氧性培养基。 在培养基灌装结束以后，必须用实验证明培养基能够支持环境环境分离菌的生长。 进行营养试验时，需要接种10-100CFU的菌液。菌株包括枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉等，以及环境分离菌。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物促生长试验 培养基 接种的培养基必须在3天内有微生物的生长。 用于环境监测的培养基也必须对其促生长特性进行测试。必须进行验证证明培养基对残留消毒剂的中和能力，能够持在测试条件下的微生物的复活（培养基中必须有中和剂） 。 外部购买的培养基也必须进行测试。 用于培养基灌装和环境监测的培养基必须经过预培养来证明其无菌性。 培养基必须有经过验证的保存期限。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

无菌检测 无菌检测是无菌产品释放时进行的一项质量控制检测 取样 该方法有有显著统计学局限性 – 只能检测大范围的污染 药典中规定了检测样品的数量及体积。 在无菌工艺生产的产品，必须对灌装过程的前、中、后以及生产过程有干扰和中断后生产的产品进行取样。 对于最终灭菌的产品，必须在先前识别的冷点处进行取样。 取样数量必须能够满足复检。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

无菌检测 设施 无菌检测必须在和无菌工艺生产过程相同的条件下进行。 B级区背景的A级区层流（也可以在隔离器中进行） 空气经过高效过滤器HEPA过滤，必须监控压差，并有超限报警 进入该区域必须经过气闸室 操作人员必须进行正确的无菌更衣 操作人员必须经过适当的培训并对其进行人员资质确认 必须制定相应的清洁，消毒，杀菌规程 应对其环境进行监测 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

无菌检测 药典中已规定了方法 培养基类型 如果产品可以过滤，推荐使用膜过滤方法 直接接种法可作为备选 通常使用大豆酪蛋白酶消化培养基 (SCD)和 液体硫乙醇酸盐培养基 (用于检测需氧和厌氧微生物) 必须验证该培养基能够支持产品中曾经出现过的一系列微生物的生长，通常这些微生物数量（浓度）较少，可能需要中和抑菌剂。 细菌3天内能够生长，霉菌5天内能够生长 购买的或自制的培养基必须灭菌，灭菌程需经过验证。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

无菌检测 培养基 培养周期 使用前必须通过营养试验（低数量的微生物） 必须有批号和有效期 至少14天的培养 培养基SCD/TSB中20-25°C培养, FTM培养基中30-35°C 培养 培养物进行定期检查 对温度进行监控，温度监控设备必须经过校验 如果产品产生浑浊、絮凝或沉淀，14天后应将适当比例的培养物（2-5%）接种到新鲜的培养基中继续培养7天 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

无菌检测 阴性对照 阳性试验对照 对于同一批培养基，应部分或全部预先培养14天后才能使用 (也可以同无菌试验一起进行) 阴性产品对照 – 应使用相似形式和包装的实际产品进行对照检测 使检测结果容易评价 应计算和记录阴性对照的污染率 阳性试验对照 抑细菌/抑真菌试验 应证明培养基能支持产品中曾经出现过的一系列微生物的生长，通常这些微生物数量（浓度）较少，可能需要中和抑菌剂 细菌3天，霉菌5天内应有明显生长 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

无菌检测 阳性对照 结果 含抗生素或防腐剂或会缓慢释放以上成分的产品推荐使用直接接种法 任何培养出的微生物都应被鉴定（遗传学就） 应在新产品和任变更时进行验证 应每年进行再验证 含抗生素或防腐剂或会缓慢释放以上成分的产品推荐使用直接接种法 证明即使在培养终点，培养基没有受到产品影响，依然能支持生长 结果 任何培养出的微生物都应被鉴定（遗传学就） 自动/半自动鉴定系统都应用标准菌种进行定期确认 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

无菌检测 解释和复试 不应检出污染菌 除非能够证明实验失败是由于与产品无关的原因引起的，方能进行复测 欧洲药典标准 (a) 无菌检查时环境监控结果不符合要求 (b) 回顾无菌试验过程，发现使用了可疑的方法，导致结果不符合要求 (c) 阴性对照有微生物生长 (d)供试品中生长的微生物经鉴定后确证是因无菌试验中所使用的物品或无菌操作技术不当引起的。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

无菌检测 解释和复试 取相同样品数进行复试 复试中有任何微生物生长，判产品不符合规定 当出现情况(a), (b) 或 (c)时应中止试验 如果试验结束进行的抑制试验未出现挑战菌的生长，也认为试验无效 出现情况(d)时必须用细菌鉴定的方法证明无菌试验分离的微生物经鉴定来自试验物料（例如培养基）和/或环境 必须使用遗传学（基因）鉴定方法 取相同样品数进行复试 复试中有任何微生物生长，判产品不符合规定 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 标准菌种的保藏 标准菌种主要用于如下： 必须保持其遗传稳定性，以维持它们的特性 培养基质量控制 检测方法验证 检测试剂的质控 必须保持其遗传稳定性，以维持它们的特性 有些微生物培养物很容易发生变异/遗传学变化，这可能会影响它的培养特性，此类菌种不能继续使用 菌种发生变异/遗传变化的概率是随着传代次数的增加而增加的-工作菌种自原始菌种传代后不应超过5代 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 标准菌种(2) 实验室必须建立一套保藏和维持标准菌种原始特征的体系。 实验室必须: 保存合适的标准菌种用于培养基，检测试剂的质量控制、以及方法验证； 确保标准菌种可追溯到公认的菌种保藏库（比如ATCC，NCTC） 确保标准菌种在实验室内的鉴定结果唯一性，可溯源 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 标准菌种 (3) 对各个标准菌株都有记录: 实验室必须建立书面规程: 必须对书面记录标准菌种的传代控制 (如原始菌种 转接保存菌株和工作菌株); 对于标准菌种的购买、保藏、维护、鉴定和传代次数都要书面记录 防止将工作菌种用作已衰退的次代菌种或原始菌种株 对各个标准菌株都有记录: 鉴定、来源、历史和接受日期 对于原始菌株、传代菌株和工作菌株都有复活、保藏、保存和存放条件的记录; 对原始菌株和/或传代菌株记录纯化和鉴定的结果; 传代菌株和工作菌株的配制日期。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 培养基质量控制 用于无菌试验和培养基灌装以外的培养基也必须进行质量控制 促生长/营养试验是可用定量或半定量的方法 对于选择性培养基和/或特殊菌种的培养基，进行阴性阳性对照 不同程度的质量控制要求取决于培养基是否： 自己配制（每批都要检测） 购买预浇制的培养基 (供应商检测培养基，实验室定期核对) Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 培养基质量控制(2) 实验室必须: 培养基的配制、质控、释放和保存都要有书面规程; 在常规存放条件下,培养基必须确立经过验证的有效期; 对每批培养基的配制和质量控制进行记录; 确保每批培养基的配制记录都能追溯到该批培养基的微生物质控记录; 根据接受标准来评估微生物质量控制检测结果 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 培养基的灭菌程序 设备校验和检查 人员 培养基灭菌过程应同产品灭菌一样,都需对灭菌过程进行验证和监控 实验室设备(比如移液枪、天平、培养箱、冰箱、温度计、灭菌釜、层流台等)都必须经过校验、定期复校和常规检查（如果条件允许） 人员 必须经过适当的培训和授权 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 生物指示剂的测试 内毒素检测 如果进行内控测试，应包有热处理步骤（确保指示剂中只i存在孢子而并非营养型微生物） 必须抽查生物指示剂，确认供应商提供的孢子浓度是否正确 内毒素检测 非肠道用药不得检出内毒素 内毒素是存在于革兰氏阴性杆菌细胞壁中的脂多糖物质，其在人体内会引起发烧 对原材料、注射用水和其他一些成品必须进行内毒素检测 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 内毒素检测 (2) LAL (美洲鲎试剂) 测试用于检测内毒素 (以前是兔温试验) LAL测试的类型 试验基于内毒素和鲎血液反应会产生凝结 LAL测试的类型 凝胶法 浊度法 比色法 内毒素检测的设备必须无热原 必须针对每个产品进行检测方法的准确性和可靠性验证 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 内毒素检测 (3) 凝胶法 常规方法 官方认可的方法 样本转入已知灵敏度的LAL试剂中恒温培养. 凝胶如果凝结表示内毒素检测成阳性。 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 内毒素检测 (4) 浊度法 动力学方法 样品先转入LAL试剂中，用分光光度计来测定增加混浊的速率或最终凝结所需的时间，然后再和标准曲线进行比对来判断 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 内毒素检测(5) 比色法 内毒素会催化LAL中一种酶的活性，该种酶会分解一种无色物质成有色物质，而它的颜色通过分光光度计来测定，然后和标准曲线来比对 可以是动力学或终点法 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

微生物实验室其他事项 内毒素检测 (6) 浊度法 比色法 动力学 反应终点 凝胶法 * (灵敏度根据试剂厂商、设备和测试条件的不同而不同) 灵敏度低至to .001 EU/ml * 灵敏度低至0.005 EU/ml 灵敏度低至0.1 EU/ml 灵敏度最低至0.03 EU/ml 可以自动化，能保存电子数据 人工读数和记录 需要酶标板或试管读数仪 需要分光光度计或酶标板读数仪 简单、费用低,需37度水浴或干阱 定量 半定量 浊度法 比色法 动力学 反应终点 凝胶法 Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009

问题? Manufacture of sterile medicines – Advanced workshop for SFDA GMP inspectors - Nanjing, November 2009