脂质体的制备 及检测 1、目的要求 2、实验原理 3、试剂与器材 4、实验步骤 5、注意事项 6、思考题 吉林大学 国家级生物基础实验教学示范中心

目的要求 1.掌握注入法制备脂质体的工艺。 2.掌握脂质体包封率的测定方法。

实验原理 60年代初，Begkan等发现磷脂分散在水中可形成多层囊，并证明每层囊均为双分子脂质膜且被水隔开，称这种具有生物膜结构的囊为脂质体。1971年Rymen等人提出将脂质体作为药物载体，即将酶或药物包裹在脂质体中。

脂质体系一种人工细胞膜，它具有洋葱似的封闭球形结构，可使药物被保护在它的结构中，发挥定向作用，特别适于作为抗癌药物载体，以改善药物的治疗作用，降低毒副作用等。 脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂，卵磷脂等，合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或水性溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层，形成椭圆形或球状结构一—脂质体。常用的附加剂为胆固醇，它也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体，其作用是调节双分子层流动性，减低脂质体膜的通透性。其它附加剂有十八胺、磷脂酸等，这两种附加剂可改变脂质体表面电荷的性质。

脂质体载药系统的优势： 1.被动靶向：脂质体进人体内可被巨噬细胞作为外界异物而吞噬，主要被单核巨噬细胞系统的巨噬细胞所吞噬而摄取，形成肝、脾等网状内皮系统的被动靶向性。 2.缓释作用：将药物包封成脂质体，可减少肾排泄和代谢，延长药物在血液中的滞留时间，使药物在体内缓慢释放，从而延长了药物的作用时间。 3.降低药物毒性：药物被脂质体包封后，有效地在肝、脾和骨髓等单核巨噬细胞较丰富的器官中浓集，对心、肾有毒性的药物或对正常细胞有毒性的抗癌药包封脂质体后，可明显降低药物的毒性。 4.提高稳定性：一些不稳定的药物被脂质体包封后，可受到脂质体双层膜的保护。

常用的脂质体制备方法： 注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法。 脂质体作为药物载体的应用： 1、抗肿瘤药物载体： 2、抗寄生虫药物载体： 3、抗菌药物载体： 4、激素类药物载体。

脂质体可分为三类： 小单室(层)脂质体：粒径在20～50nm，凡经超声波处理的 脂质体混悬液，绝大部分为小单室脂质体； 多室(层)脂质体：粒径约在400～3500nm； 大单室脂质体：粒径约为200～1000nm，用乙醚注入法制备 的脂质体多属这一类。 脂质体包封(裹)率的测定 ： 包封率％＝（C总-C游离） /C总 × 100 ％ 式中C总------脂质体混悬液中的药物浓度 C游离------未包入脂质体中的药物浓度 影响脂质体包封率的因素有多种，如磷脂质的种类，组 成比例，制备方法及介质的离子强度等。

包封率的测定方法： 凝胶过滤法：常用凝胶为Sephadex G50、 G100或Sephrouse4B、6B。 超速离心法 透析法 超滤膜过滤法

薄膜分散法：是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声 处理，得到小单室脂质体。特点是操作简便，但包封率 较低。 脂质体的制法有多种，可按药物性质或需要进行选择。 薄膜分散法：是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声 处理，得到小单室脂质体。特点是操作简便，但包封率 较低。 注入法：根据所用溶解磷脂质的溶剂，可分为乙醚注入法和乙醇注入 法。乙醚注入法是将磷脂、胆固醇和脂溶性药物及抗氧剂等 溶于适量的乙醚中，在搅拌下慢慢滴入50～60℃水性溶液 中，蒸去乙醚，即可形成脂质体。此法适于实验室小量制备 脂质体。本实验采用此法制成脂质体，安定为模型药物。乙 醇注入法制备脂质体，脂质体混悬液一般可保留10％～20％ 乙醇。最近还有人研究用Freon为溶剂溶解磷脂质等脂溶性成 分，采用注入法制备脂质体。此法适于不耐热的药物。 反相蒸发法：是制备多层脂质体或大单室脂质体的方法，此法包封率 高。 冷冻干燥法：适于在水中不稳定的药物制备脂质体。 熔融法：适于制备多相脂质体，制得的脂质体稳定，可加热灭菌。

试剂与器材 1.试剂：水杨酸 、卵磷脂 、胆固醇 生理盐水 2.器材：磁力搅拌器、光学显微镜、超滤 器、分光光度计

实验步骤 1.处方 水杨酸 0.25g 卵磷脂 2g 胆固醇 0.2g 生理盐水 加至50ml

2.操作 (1)磷脂、胆固醇乙醇溶液的配制：取处方量的卵磷脂、胆固醇溶于15～20ml的乙醇中，即得。 (2)水杨酸脂质体的制备：取生理盐水约30ml于50ml烧杯中，置磁力搅拌器上，加热至50～60℃，将含卵磷脂、胆固醇的乙醇液慢慢滴加于生理盐水中后继续搅拌约10min.，加入水杨酸后保持温度60℃，使乙醇完全蒸发除去，再继续搅拌2h，加生理盐水至50ml，取下磁力搅拌器，镜检，即得。

(1)脂质体的形态与粒度：显微镜（油镜） 3.质量检查与评定 (2)异物：显微镜下观察有无异物。 (3)包封率的测定（超速离心法）：取1.0ml水杨酸脂质体混悬液置离心机上，10000转/分离心5分钟。取0.1ml上清液置试管内，加蒸馏水9.9ml，摇匀，加入2ml硫酸铁胺溶液在530nm波长处测定吸光度，由标准曲线计算未包入脂质体中水杨酸的浓度。

注意事项 (1)溶解磷脂和胆固醇的乙醇溶液应澄清，否则需过滤除去杂质。 (2)乙醇液的注入，可用lml的注射器或细滴管滴至生理盐水的内部，每滴一滴，须使产生的泡沫消失后再加第二滴。 (3)整个实验过程中，温度可控制在50～60℃，操作中始终伴随搅拌，加入安定后搅拌的时间不得少于2h，因脂质体形成有个过程，温度、滴加速度和搅拌时间对脂质体的形成均有影响。

思考题 1.注入法制备脂质体成败的关键是什么？ 2.制备脂质体是加入胆固醇的目的是什么？