新药临床前毒理学评价 （药物非临床安全性研究）

主要内容 急毒试验； 长毒试验 特殊毒性试验 其它毒性试验 局部给药毒性试验 药物依赖性试验

总目的 找出毒性剂量； 确定安全剂量范围 发现毒性反应 寻找毒性靶器官 毒性可逆与否 解救措施

CFDA颁发的新药临床前毒理学评价技术指导原则 起草时间 发布时间 状态 药物生殖毒性研究技术指导原则 2005 2006 颁布 中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则 2003 化学药物急性毒性研究技术指导原则 中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光变态反应）研究技术指导原则 中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则 化学药物长期毒性试验技术指导原则 中药、天然药物局部刺激性和溶血性研究技术指导原则 参考网站(http://www.cde.org.cn/page/framelimit.cbs?ResName=zdyzxz)

CFDA颁发的新药临床前毒理学评价技术指导原则 起草时间 发布时间 状态 药物单次给药毒性研究技术指导原则 2012 2015 颁布 药物重复给药毒性研究技术指导原则 药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则 药物毒代动力学研究技术指导原则 药物非临床安全性评价供试品检测要求的Q&A 参考网站(http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1616/101015.html )

急毒 定义：指动物一次或24小时内多次接受一定剂量的受试物，动物在14d内出现的毒性反应。

急毒 目的： 了解新药急毒的强弱； 求出相对毒性参数：LD50、TI、SM等 为长毒等提供剂量设置依据； 化学物质的急性毒性分级标准（WHO，1977） 求出相对毒性参数：LD50、TI、SM等 为长毒等提供剂量设置依据； 获取新药毒性反应信息，为临床毒性监护提供参考： 如中毒症状、靶器官、致死原因、种属差异等。

基本原则 GLP 具体问题具体分析 实验设计应符合随机、对照、重复的原则。

基本内容 受试物 动物 中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。 种类：一种啮齿类（鼠）加一种非啮齿类（犬）。若未采用非啮齿类动物应阐明其合理性。 动物数：小动物>10只，大动物>4只。 性别：雌雄各半。 体重：健康成年动物，初始体重不应超过或低于平均体重的20%。

基本内容 给药途径 剂量和分组 至少包括临床拟用途径和一种能使原形药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。 经口给药前一夜禁食，不禁水。 非啮齿类动物给予出现明显毒性的剂量即可，没有必要达到致死水平。 应从未见毒性剂量到出现严重毒性 (危及生命的) 剂量（3-5个剂量），同时设空白和/或溶媒（辅料）对照组。

基本内容 给药体积： (见附录) 观察时间：给药后数小时，每天上下午各1次 观察指标 一般指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等） 死亡情况（症状起始时间、持续时间、死亡时间、濒死前反应等） 体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。

基本内容 临床观察表

基本内容 剖检 结果处理和分析 所有动物应大体解剖，发现器官体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查。 各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率 。 判断反应可能涉及的组织、器官或系统。 找出NOAEL 、 MTD 、 MFD 、LD50等。 分析受试物其他安全性试验、临床试验、质量控制方面应注意的问题和开发前景。

几个概念 最大无毒性反应剂量（No observed adverse effect level, NOAEL）： 指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量。 最大给药量（Maximal feasible dose，MFD） ：指动物单次或24小时内多次（2~3次）给药所采用的最大给药剂量。 （一般指毒性较低的药或测不出毒性的药） 最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）： 动物能够耐受的不引起死亡的最高剂量。 半数致死量（Median lethal dose, LD50）： 引起一半动物死亡的剂量。

常用方法 近似致死剂量法 最大给药量法 固定剂量法 上下法（阶梯法，序贯法） 累积剂量设计法（金字塔法） 半数致死量法

长毒 定义：指反复多次给药（＞14d），动物出现的毒性反应。

长毒 目的： 预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量效和时效关系、以及可逆性等； 判断受试物重复给药的毒性靶器官或靶组织； 如果可能，确定未观察到临床不良反应的剂量水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL） ； 推测第一次临床试验（First in Human, FIH)的起始剂量，为后续临床试验提供安全剂量范围； 为临床不良反应监测及防治提供参考。

基本原则 GLP 具体问题具体分析 整体性 随机、对照、重复

基本内容 受试物 动物 中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。 种类：在重复给药毒性试验前应采用合适的试验方法对实验动物种属或品系进行选择，一种啮齿类（大鼠）加一种非啮齿类（犬）。（不同情况中药、天然药物的试验要求有所不同） 动物数：大鼠雌、雄各≥15只，（主试验组10只，恢复组5只）犬或猴可为雌、雄各≥ 5只。 （主试验组3只，恢复组2只） 年龄：大鼠为6~9周龄；Beagle犬为6~12月龄；猴3～5岁。

基本内容 给药途径 剂量和分组 与临床拟用药途径相同。否则应说明理由。 药品加入饲料中的量＜10% 至少设高、中、低三个剂量给药组和一个溶媒（或辅料）对照组。 高剂量原则上应使动物产生明显的毒性反应，甚至出现个别动物死亡。低剂量原则上应高于动物药效学试验的等效剂量，并不使动物出现毒性反应。

基本内容 剂量设置参考方法 大鼠高中低剂量：1/10、1/50、1/100 LD50 或1、1/3、1/10MTD 等效剂量 项目 人 犬 猴 兔 豚鼠 大鼠 小鼠 成年体重(kg) 70 12 4 1.5 0.4 0.2 0.02 用药量折算(mg/kg) 1 2.2 3.1 4.3 5.4 11

基本内容 给药频率 原则上应每天给药，给药期限长（3个月或以上）的药物每周至少应给药6天。 给药期限

观察指标 一般状况观察 ：外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便、摄食量、体重、给药局部反应。 血液学指标 ： 血液生化学指标 ： 尿液检查 : 心电图、体温（非非啮齿）：标准II导联检查，测定R-R间期、P-R间期、Q-T间期、S-T段和T波，HR。 尸解、脏器系数、病理学检查

指标检测次数 给药前期、给药中期、给药后期和停药恢复期各检查1次(病理只最后1次)，其中，非啮齿类给药前期检测2次。 犬所有剂量组都要进行组织病理学检查。大鼠只对高剂量组和对照组检查，如果高剂量组出现组织病理学变化时，才对低剂量组进行检查

结果处理和分析 正确理解试验数据的意义 啮齿类组均值意义＞单个动物数据的意义，非啮齿类单个动物的试验数据很重要。 正确判断毒性反应 判断毒性反应、动物适应性改变或正常的生理波动。 动物毒性反应对于临床试验的意义 试验的结果一般不会完全再现于人体临床试验，但先要假设会。 综合评价 最终应落实到受试物的临床不良反应、临床毒性靶器官或靶组织、安全范围、临床需重点检测的指标，以及必要的临床监护或解救措施。

特殊毒性试验 致突变试验（遗传毒性试验） 生殖毒性试验 致癌试验 微生物回复突变试验（Ames试验） 染色体畸变试验 微核试验 2014药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则

复习思考题 名词：急毒、长毒、最大无毒反应剂量、MTD、MLD、LD50 急毒、长毒试验的目的 急毒试验结果要分析的主要内容 长毒试验的动物要求（种类、数量、年龄等） 长毒给药频率和期限 长毒的主要观察指标 特殊毒性试验主要包括哪些？

化学物质的急性毒性分级

GLP基本内容 SOP 具有适用的设施 上岗培训 仪器设备使用记录、校正及维护保养记录 质量保证部门 方案签字（专题负责人、研究室主任，主办者） 原始记录和证实 总结报告并签字 资料归档

常用实验动物不同途径常用~最大给药体积(ml) 小鼠 20g 大鼠 200g 豚鼠 家兔 2.5kg 犬 10kg ig 0.2-1 1-4 1-5 5-10 50-100 ip 1-3 2-5 5-15 im 0.1-0.2 0.2-0.5 0.5-1 iv 1-2 3-10 35-50 sc 0.1-0.5 0.5-2 注：为常用量-最大量

近似致死剂量法 适用于非啮齿类，6只：犬（4-6M）；猴（2-3Y） 估计可能的毒性和死亡剂量范围：如50-500mg/kg 50%递增设计剂量序列表并每隔一个剂量给药： 50 75 110 170 250 380 500 存活 存活 死亡 死亡 存活 近似致死剂量： 110～170 170～250

LD50测定 预实验获得0~100%死亡剂量范围，在此范围内设计5个剂量组，间距0.65~0.85倍，其中，最大剂量死亡率>70%，最小剂量死亡率<30%，中剂量死亡率接近50%。 得出各剂量组动物死亡个数，用bliss法计算LD50。

LD50测定例表 剂量 死亡数（试验动物每组总数10只） 0%最高死亡剂量：200 220 1（<30%） 370 3 630 4 220 1（<30%） 370 3 630 4 1075 7 1770 9 (>70%) 100%最低死亡剂量：2000 10

长期毒性试验给药期限（旧原则） （不包括恢复期） 临床疗程 啮齿类动物 非啮齿类动物 可支持的临床研究 单次给药 2周 I-III期 ≤2周 1个月 ＞2周(中药、天然药) I期 　　　　　　　　　　 ≤1个月 II期 3个月 III期 　　　　　　　　　　 ≤3个月 6个月 　　　　　　　　　 ≤6个月 9个月 　　　　　　　　　　 ＞6个月

长期毒性试验给药期限（新原则） （不包括恢复期） 支持药物临床试验 最长临床试验期限 重复给药毒性试验的最短期限 啮齿类动物 非啮齿类动物 ≤2周 2周 2周～6个月 同临床试验 ＞6个月 6个月 9个月1，2 1.非啮齿类动物不超过6个月期限的试验可接受情况： 当免疫原性或耐受性问题使更长期限的试验难以进行时； 重复、短期用药（即便临床试验期限6个月以上）的疾病，如偏头痛、勃起障碍、单纯性疱疹等的反复间歇给药时； 拟用于危及生命的疾病（如进展性疾病、辅助使用的肿瘤化疗药）时。 2.如果儿童为主要拟用药人群，而已有毒理学或药理学研究结果提示可能发生发育毒性，应考虑在幼年动物上进行长期毒性试验。该试验应采用合适年龄和种系的动物，试验观察指标应针对发育方面的毒性，试验期限犬12个月、大鼠6个月。12个月的犬试验期限应涵盖其发育的全过程。这些幼年动物的长期试验可用于替代标准的长期毒性试验和单独的幼年动物试验。

长期毒性试验给药期限（新原则） （不包括恢复期） 支持药物上市申请 临床拟用期限 重复给药毒性试验的最短期限 啮齿类动物 非啮齿类动物 ≤2周 1个月 2周～1个月 3个月 1个月～3个月 6个月 >3 个月 9个月 1.非啮齿类动物不超过6个月期限的试验可接受情况： 当免疫原性或耐受性问题使更长期限的试验难以进行时； 重复、短期用药（即便临床试验期限6个月以上）的疾病，如偏头痛、勃起障碍、单纯性疱疹等的反复间歇给药时； 拟用于危及生命的疾病（如进展性疾病、辅助使用的肿瘤化疗药）时。 2.如果儿童为主要拟用药人群，而已有毒理学或药理学研究结果提示可能发生发育毒性，应考虑在幼年动物上进行长期毒性试验。该试验应采用合适年龄和种系的动物，试验观察指标应针对发育方面的毒性，试验期限犬12个月、大鼠6个月。12个月的犬试验期限应涵盖其发育的全过程。这些幼年动物的长期试验可用于替代标准的长期毒性试验和单独的幼年动物试验。

血液学检测指标 血液学指标(红色为必测项) 活化部分凝血活酶时间 ●红细胞计数(RBC) ●血红蛋白(HGB) ●红细胞容积(HCT) ●平均红细胞容积 ●平均红细胞血红蛋白 ●平均红细胞血红蛋白浓度 ●网织红细胞计数(RET) ●白细胞计数及其分类 ●血小板计数(PLT) ●凝血酶原时间(PT)和 活化部分凝血活酶时间

血液生化学指标 血液生化学指标 ●天冬氨酸转氨酶(AST) ●丙氨酸转氨酶(ALT) ●碱性磷酸酶(ALP) ●γ-谷氨酰转移酶（非啮齿类动物） ●尿素氮(BUN) ●肌酐(Cre ) ●总蛋白（TP） ●白蛋白（ALB） ●血糖（Glu） ●总胆红素（Bil） ●总胆固醇(Cho) ●甘油三酯 ●钠离子浓度 ●钾离子浓度 ●氯离子浓度 ●肌酸磷酸激酶

尿液分析指标 非啮齿类动物尿液分析指标 ●尿液外观 ●比重（SG） ●pH值 ●尿糖（Glu） ●尿蛋白（Pro） ●尿胆红素（Bil） ●尿胆原（Uro） ●酮体（Ket） ●潜血（BLD） ●白细胞（WBC）

需称重并计算脏器系数的器官 ●脑 ●心脏 ●肝脏 ●甲状腺（含甲状旁腺）1 ●脾脏 ●肾脏 ●肾上腺 ●胸腺 ●睾丸 ●附睾 ●子宫 ●卵巢 1.非啮齿类

需进行组织病理学检查的脏器、组织 ●脑（大脑、小脑、脑干） ●脊髓（颈、胸、腰段） ●垂体 ●胸腺 ●甲状腺、甲状旁腺 ●骨（股骨）骨骼肌皮肤、 ●食管 ●唾液腺 ●胃 ●盲结十二指空回直肠 ●肝脏 ●胆囊* ●肾脏 ●肾上腺 ●脾脏 ●胰腺 ●气管 ●肺（附主支气管） ●主动脉 ●心脏 ●附睾、精囊（如果有） ●睾丸 ●卵巢、输卵管 ●子宫和子宫颈、阴道 ●前列腺 ●乳腺 ●坐骨神经 ●膀胱 ●眼（检查异常时）* ●视神经* ●给药局部和异常组织 ●骨髓（胸骨） ●淋巴结（一个与给药途径有关、另一个在较远距离） *为啮齿类动物免检