日期：2013/10/07 課程：生物化學實驗 指導老師：蔡美玲 老師 還原醣之鑑定實驗 日期：2013/10/07 課程：生物化學實驗 指導老師：蔡美玲 老師

醣類定義 Carbohydrate是地球上含量最豐富的一種生物分子。由碳、氫、氧三大元素所組成，分為醛醣酮糖及其衍生物。

醣類分子的生理功能 作為生物體體內能量的來源:生物體內能將植物澱粉與動物肝醣快速轉換成glucose作為代謝來源。 構成訊息傳遞分子:ribose與deoxyribose分別構成了RNA與DNA的部分結構。

作為生物保護結構:多醣類通常是細菌及植物細胞壁的主要成分。 潤滑與附著:醣類分子能與protein、lipid等其他生物分子加以結合形成glycoprotin、glycolipid等。

醛糖 glyceraldehydes 酮糖 glyceraldehydes

不對稱碳中心:以碳原子為中心，其所連接的四個原子基團皆不同而稱之，會因連接基團的強弱產生不同旋光角度，分為左旋(l)和右旋(d)。 單醣類的變旋作用:糖類分子溶於液體中時會形成半縮醛或半縮酮的結構，更進一步直鏈形成環狀結構，而第1個碳上的氫氧基方向不同，便會產生α與β不同型式的結構。

單糖衍生物:單糖分子能與其他化學取代基相結合產生許多糖類衍生物，如:胺基榶(aminosugar)、去氧醣類(deoxysugars)、酸性醣類(acidic sugars)等。 還原性:醣類分子本身可被中性溫和的氧化試劑如Fe2+及Cu2+加以氧化，故可做為還原劑加以使用。

雙醣及寡醣 雙醣及寡醣主要是以醣甘鍵將兩個或是兩個的以上分子以α-1,4、 α-1,6、β -1,4 、β -1,6方式鍵結，且有直鏈及支鏈的差異。 常見雙醣有麥芽糖、蔗糖、乳糖等。比較特別的是蔗糖為非還原糖。 常見的寡醣則有Mannotriose(甘露糖)、 Rhamninose(鼠李糖)、 Raffinose(棉子糖)等。

多醣 多醣類在生物體內扮演了結構支撐與能量儲存這兩項重要的生理功能。 也參與了一些自然發生之碳水化合物分子角色扮演，如:骨骼連接之潤滑劑、血型的決定、植物及細菌的細胞壁等。 常見的多醣類有澱粉、肝醣、纖維素、幾丁質等。

澱粉(starch) α-D-glucose又稱為葡聚糖(glucosan)。 為許多植物的主要碳水化合物，不溶於水，遇碘液呈藍紫色反應。 結構由直鏈(amylose)及支鏈(amylopectin)所組成。

肝醣(glycogen) α-D-glucose又稱動物性澱粉。 為動物體內肝臟及肌肉的主要存在碳水化合物型式。 其結構類似amylopectin的樹狀結構，但分支更多，分子量約在1x106~3x106 Da。 不具還原性，遇碘液呈紅色。

纖維素(cellulose) 由α-D-glucose 以β-1,4鍵結合成。 為植物及細菌的細胞壁組成成分。

幾丁質(chitin) 為β-D-N-acetyl-glucosamine以β-1,4的方式連結而成的線狀結構。 為昆蟲及甲殼類之外骨骼的主要成分。

還原醣之鑑定實驗

本實驗利用簡易之化學反應區分醣類的結構特性，針對各種結構特性於呈色型態、時間快慢等物理或化學性質加以鑑定。 實驗如下： (1) Benedict Test (2) Barfoed Test

綱要 原理 試劑 步驟 結果 討論

單醣和某些雙糖是還原劑 葡萄糖和其他糖類可以還原銅離子，因此稱為還原糖（reducing sugars）。 還原糖的還原力來自於游離的醛基或酮基。

斐林反應(Fehling reaction) 裴林試劑是含有硫酸銅與酒石酸甲鈉之NaOH 溶液，硫酸銅與NaOH 溶液混合加熱會生成氧化銅沉澱，若加入還原醣則產生黃色或磚紅色的氧化亞銅沉澱。

醛糖 (glucose) 酮糖 (fructose)

斐林試劑缺點:在強鹼性條件下使醣產生分解、氧化、還原等作用，造成測試醣含量之靈敏度較低。

(1) Benedict Test 實驗原理 ：本法源自Fehling Tset，但將其中試劑變成單一溶液，使用上更方便且穩定。具有游離或游離趨勢醛或酮基之醣類會將鹼性之銅還原(或醣被氧化)而形成有色(黃至橘紅色)之氧化亞銅，具此種特性之醣類稱還原糖。 醛醣氧化成aldonic acids 及其他產物，酮醣氧化成低分子量之氧化產物之混合物。 目的：該反應可區別醛糖和酮糖。

試劑 1. Benedict 試劑，含: (1) 10 ％ 無水 Na2CO3 (碳酸鈉，sodium carbonate） (2) 0.025 ％ K4〔Fe(CN)6〕(亞鐵氰化鉀， Potassium ferrocyanide） (3) 20 ％ Na 或 K-citrate (檸檬酸鈉/鉀) (4) 1.8 ％ 無水 CuSO4 (硫酸銅) →須精秤 (5) 12.5 ％ KSCN 硫氰酸鉀 (Potassium thiocyanate)

試劑 2. 1％ 糖試液: (1) Glucose (葡萄糖) (2) Fructose (果糖) (3) Maltose (麥芽糖) (4) Lactose (乳糖) (5) Sucrose (蔗糖) (6) Starch (澱粉)。

步驟 1. 取 2 ml 之糖試液於試管中(6管)。 2. 加入 2 ml Benedict 試劑完全混勻。 3. 所有試管同時置於沸水浴中，2~3分鐘後觀察。

結果 如果溶液中還原糖含量較低，產生的氧化亞銅便會相應減少，因此試驗後可能只會出現綠色、混濁的黃色或橙色沉澱物。

討論 1. 沸水須加入沸石，以防突沸。 2. 此試劑鹼性來自 NA2CO3 (pH10.5) 。 3. 若試劑不加入Na-citrate則會有部分CuCO3沉澱，因為 Cu2+ 與 Citrate 形成可溶而穩定之錯合物。 4. 本實驗可用於病理學上，尿中糖量之檢查。 5. 沉澱顏色不同，乃因還原醣之濃度之故。 6. 50 mg 之葡萄糖可還原 25 ml 之 Benedict試劑。 7. 本實驗受尿酸和肌酸之影響甚少。

(2) Barfoed Test 原理：本實驗原理類似 Benedict test，唯一不同之處在於所用溶液為酸性，且銅離子可於雙醣存在下測出單醣。 單醣在 Barfoed 試劑的作用下，約 5 分鐘左右能將 Cu2+ 還原成橘紅色的氧化亞銅，而 10 分鐘左右有大量沉澱產生即為雙醣。 目的：該反應可用於區別單醣和雙醣。

試劑 1. Barfoed試劑 (Tauber-Kleiner modification) : 4.8 % 醋酸銅溶液 (Copper acetate)。 *分子式：(CH3COO)2Cu·H2O 2. 1%糖試液: (1) Glucose (葡萄糖) (4) Lactose (乳糖) (2) Fructose (果糖) (5) Sucrose (木糖) (3) Maltose (麥芽糖) (6) Starch (澱粉)

步驟 1. 各試管中加入 2 ml 糖試液。 2. 各管加入 2 ml 之 Barfoed 試劑混勻。 3. 將所有試管同時置入沸水浴中。 4. 沸水浴 15 分鐘取出試管，放置20分鐘以上，觀察紀錄每個試管顏色變化與先後順序。

討論 1. 若有混濁產生，請記下時間。 2. 加熱時間控制須準確，若加熱過長則雙醣產生水解，也會得 到與單醣類似之結果。 3. 酸性使試劑還原作用減弱，只有單醣類有作用，但若加熱時 間延長，則雙醣水解，亦有陽性反應。 4. 單醣為直鏈式才有還原力。 5. 5~7分鐘內有橘紅色沉澱者為單醣；7~12分鐘內有大量沉澱產 生者為雙醣 (但蔗糖則不發生沉澱)。

注意事項 1. 酮基本身並沒有還原性，只有在變為烯醇式後，才顯示還原作用。 2. 醣的還原作用生成氧化亞銅沉澱的顏色決定於顆粒的大小，Cu2O顆粒的大小決定於反應速度。 3. 反應速度快時，生成的Cu2O的顆粒較小，呈黃綠色；反應慢時，生成的Cu2O顆粒較大，呈紅色。

注意事項 4. 有保護膠體存在時，常生成黃色沉澱。實際生成的沉澱含有 大小不同的Cu2O顆粒，因而每次觀察到顏色可能略有不同。 5. 溶液中還原糖的濃度可以從生成沉澱的多少來估計，而不能 依據沉澱的顏色來區別。 6. Barfoed 反應產生的Cu2O沉澱聚集在試管底部，溶液仍為深 藍色。 7. 應注意觀察試管底部紅色的出現，它與一般還原性實驗不相 同，觀察不到反應液由藍色變綠色變黃或變紅的過程。