主讲:广东教育学院生物系 吴映明 E-mail: wuym88@163.com 微生物实验技术(精选) 主讲:广东教育学院生物系 吴映明 E-mail: wuym88@163.com
主要内容: 一、细菌培养基的制备(简易培养基) 二、使用家用压力锅灭菌的方法 三、无菌操作室及无菌操作技术 四、微生物实验技术操作规范示例
一、细菌培养基的制备 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基 :牛肉膏 3g , 蛋白胨 10g,NaCl 5g, 琼脂 15~20g,水 1000mL,pH7.4~7.6 简易培养基配方: 1.凉粉牛奶培养基配方: 凉粉 50g 纯牛奶 100g 水 1000mL pH7.4~7.6 2.牛奶(豆浆)琼脂培养基配方: 纯牛奶(或豆浆) 100mL NaCl( 或食盐) 0.5g 琼脂 16g 水 1000mL pH7.2-7.4 3.马蹄粉牛奶培养基: 马蹄粉 50g 纯牛奶 100g 水 1000mL pH7.4~7.6
培养基制备的一般过程: 1.称量和溶化 2.调节pH值:1N的盐酸或1N的氢氧化钠溶液调节酸碱度 3.过滤:用双层纱布。没特殊要求可不过滤。 4.分装:分装于三角瓶的,不超过其容量的一半;制备斜面培养基的,分装于试管不超过其管长的1/5。 5.加棉塞并包扎:方法见后示范 6.灭菌:121℃维持20—30分钟 7. 摆斜面或倒平板培养(将已灭菌的培养基倒入已灭菌的培养皿中)
二、使用家用压力锅灭菌的方法 常用高压蒸汽灭菌锅 家用压力锅
1. 加水约1000mL,往锅内放一块纱布
2.放入待灭菌物品
3.按要求盖严锅盖 4.加热至沸腾后,排净锅内空气(约3分锅)
5 . 盖上限压阀 6.待锅内压强达到限压临界时,开始计时,维持30分钟
7.打开限压阀,待锅内没蒸汽喷出后取出灭菌物品 已灭菌的培养基 已接种的平板培养基
三、无菌操作室及无菌操作技术 (一)无菌操作室的设计要求 1.标准接种室设计要求: (1)接种室6~8平方米,缓冲间2~3平方米,高度2~2.2米 (2)使用推拉门,室内结构要有利于清洁和消毒处理 (3)接种室和缓冲间要安装紫外灯及日光灯各一盏
单人接种箱 双人接种箱
(二)无菌操作室(或接种箱)的消毒 (1)薰蒸法:每立方米空间用10毫升福尔马林(甲醛36%左右的水溶液),加入5克高锰酸钾,密闭薰蒸24小时; 甲醛挥发气穿透力极强,甲醛能与微生物细胞蛋白质的氨基结合而使之变性,对人的皮肤、眼和呼吸道有毒害和刺激作用。 残留在室内的甲醛可用氨水吸收,氨与空气中的甲醛结合,形成白色无臭粉末(乌洛托品),对人体无毒,氨的用量为甲醛的一半。
薰蒸消毒过程
(2)照射法:用紫外线杀菌灯照射半小时,空气中的细菌数可下降96%; 紫外线可导致细胞内核酸和酶发生光化学变化而使细胞死亡;另外,紫外线还可使空气中氧气产生臭氧,臭氧也具有杀菌作用。 紫外线灯管有效作用距离为1.5~2米,以1.2米最好,因此应将紫外线灯安装在距工作台上方1.2米处。它对物体的穿力很差。 经紫外线照射的菌体,若再暴露在可见光下,受损伤的一部分细胞可恢复其活力,称光复活。故用紫外线消毒时,应保持室内无可见光,关闭紫外线灯后不要马上开启日光灯
(3)喷雾法:用化学消毒剂对接种室(箱)进行喷雾消毒。常用消毒剂如下: 石炭酸(又名苯酚):有特殊气味(酚臭)和腐蚀性,对皮肤有刺激性。使用浓度为5%。 煤酚皂溶液(亦称来苏尔):为50%煤酚的肥皂溶液。使用浓度为2~3%(有效浓度)。 新洁尔灭(十二烷基甲基苯甲基溴化铵):浅黄色胶体状,具有芳香气味。原液浓度为5%,使用浓度为0.25%。 酒精:70~75%消毒效果最好。