食品微生物学实验

食品微生物学实验 实验一 微生物培养 基的配制和灭菌 实验二 放线菌和真 菌形态的观察

实 验 一 微生物培养基的配制和灭菌 实验目的 实验材料与试剂 实验程序 灭菌与思考 培养基种类 培养基配置步骤 不同配方的培养基

一、实验目的 了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 了解几种灭菌方法，，掌握干热灭菌法、加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。

（二）实验材料和试剂 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O 等。 仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。 其它物品：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、牛皮纸、绳索、棉花、标签等。

（三）实验程序 培养基的配制 三种培养基的配方及配制 培养基和玻璃器材的 灭菌方法

培养基的种类 培养基的种类 据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2～0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。 据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2～0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。

常用凝固剂 常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。

培养基配制的基本步骤 称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 过滤 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。 灭菌 摆斜面 灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。 按培养基 配方称量 加水加 热熔化 调节 pH值 过滤 分装 包装 灭菌 检查灭菌 彻底与否

培养基配制的基本步骤 分装 分装 分装 摆斜面 摆斜面 摆斜面

培养基配制的基本步骤 包扎

培养基的配方及配制-1 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 氯化钠 3g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.2~7.4 灭菌 0.1MPa，25～30min

以配制200mL培养基为例：（30％牛肉膏、50％蛋白胨，30 ％氯化钠） 吸取 30％牛肉膏 2mL；50％蛋白胨 2mL；30％氯化钠 2mL；加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200mL。用玻棒搅匀，在电炉上稍加热，调 pH 至7.4 加琼脂4g，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试带有棉塞的无菌试管，装置1／5的试管高度共12支，作斜面培装管。 用铝壳试管帽各装10ML，越试管高度的1／2以上，用作分离时倒平板用。

用于活化菌种， 或培养菌种的斜面 用于保存菌种的斜面

搁置斜面 当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。

注：试管加棉塞(最好) 培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。

培养基的配方及配制-2 马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基），其配方如下： 去皮马铃薯 200g 蔗糖（或葡萄糖） 20g 自来水 1000mL 琼脂 20g pH 自然 灭菌： （含蔗糖）0.1MPa 20rain （含葡萄糖）0．1kg／cm 30min 马铃薯须煮沸30min之后，要用纱布过滤。

培养基的配方及配制-3 淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause´1），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。 可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4• 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4• 7H2O 0.01g 琼脂 20g 自来水 1000mL 灭菌： 0.1Mpa, 30min 淀粉先用冷水调成糊状，倒入煮沸的水中。

无菌水的制备 100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水45.0mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。

清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。 棉塞的制作 包扎培养皿、涂棒和吸管等。

培养基和玻璃器材的灭菌方法 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 加压蒸汽灭菌法 其步骤如下： 1.加水：灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。 2.通电：接通电源，进行加热。 3. 排气：排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.恒温灭菌：当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.结束：灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。

培养基和玻璃器材的灭菌方法 间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。

紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0 紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。 化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂，详见表6—4。

化学药剂消毒灭菌

思考 固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？ 培养基中加琼脂的作用是什么？ 干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？ 如何检查培养基灭菌是否彻底？

谢谢 ！