第二章 植物组织培养实验室的基本设备 和一般技术

【主要内容】 一、组培实验室的设置 二、组培实验室常用仪器设备及必要的器皿 三、植物组织培养的一般技术 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

【学习目的与要求】 了解植物组织培养实验室的设置及基本设备，学习基本仪器设备的使用原理与方法，掌握植物组织培养的一些基本技术。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

一、组培实验室的设置 1. 化学实验室 主要进行器具的洗涤、干燥和保存;药品的称量、溶解及配制;培养基的分装、包扎和灭菌;植物材料的预处理,培养材料的观察分析等。 2. 接种室 主要进行植物材料的接种.培养物的转移.试管苗的继代等. 3. 无菌培养室 是人工条件下培养接种物及试管苗的场所. 4. 洗涤室 若需成批生产时,需要一间单独的洗涤室. 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

组培实验室的设置 5.观察室 放置显微镜.解剖镜或照相设备,便于对实验材料进行认真观察、分析和照相。 6.储存室 暂时不用的器皿.用具的存放,也可用作种质保存。 7.温室 用于试管苗的炼苗、移栽;植物材料的预培养等。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

1. 化学实验室 药品的称量、溶解和保存注意事项： 第一，药品称取要精确，大量元素用于托盘天平称，其他用分析天平。 第二，称好的药品分别放于小烧杯中，先用少量蒸馏水完全溶解，最后倒入容量瓶，定容到规定的体积；铁盐应先溶EDTA钠盐，再用该溶液去溶解硫酸亚铁， 定容到规定的体积，以免发生氧化。 第三，容量瓶中的母液应倒入棕色试剂瓶。贴上标签，放入冰箱保存。母液应勤配快用，若放置日久，发现浑浊、絮状沉淀，则失效不能再使用。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

２.接种室 接种室也叫无菌操作室，是进行试管苗接种继代的场所，是试管苗生产中最关键的地方，它关系到试管苗的污染率、接种工作效率等。 接种室要干爽、清洁、明亮，在进口处应有缓冲间，用于进入接种室前更衣换鞋。缓冲间要安装紫外灯用于空气灭菌。接种操作在超净工作台上进行。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

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２.接种室 超净工作台的工作原理是，鼓风机将外界空气从低效过滤器粗滤尘埃，再将空气通过特制的微孔泡沫塑料片层叠组成的高效过滤器过滤消毒，它能除去直径0.3微米的尘埃、细菌和真菌孢子，吹出的气体形成连续不断的无尘无菌的空气层流，以0.35-0.55米／秒的流速送到操作台面。超净工作台使用前应用紫外灯照射30－40分钟 。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

２.接种室 超净台使用时间长了过滤器会堵塞，一般低效过滤器每半年清洗一次，高效过滤器视情况3--4年更新一次。每周开紫外灯2小时杀菌一次 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

３.无菌培养室 无菌培养室最重要的是要恒温、恒湿、无尘且空气流通。温度应维持在25度左右，相对湿度应在50%-60%。培养室内有规律的安放培养架或摇窗。 培养架可以是铝合金、三角铁、不锈钢或木制框架，整个架子的高度可根据房间的高度确定，以充分利用空间，每个架子分为若干层，每层的层高应在40CM左右，太高浪费空间，太低则上下层温度影响较大。架宽应在45CM左右，每层安装2支40W日光灯。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

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３.无菌培养室 培养室内所有光照和黑暗时间由定时器自动控制。 　培养室内所有光照和黑暗时间由定时器自动控制。 整个培养室内还应装有多个紫外线灯，以便能定时对整个房间进行杀菌处理，特别是在夏天潮湿、霉雨季节，最好每天在晚上用紫外线灯杀菌30分钟以上。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

３.无菌培养室 无菌室应定期用70%酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒，用2%新洁尔灭抹拭台面和用具(70%酒精也可)，用福尔马林(40%甲醛)加少量高锰酸钾定期密闭熏蒸，配合紫外线灭菌灯(每次开启15分钟以上)等等消毒灭菌手段，以使无菌室经常保持高度的无菌状态。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

３.无菌培养室 接种箱内部也应装有紫外线灯，使用前开灯15分钟以上照射灭菌，但凡是照射不到之处仍是有菌的。在紫外线灯开启时间较长时，可激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子，这种气体成分有很强的杀菌作用，可以对紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。由于臭氧有碍健康，在进入操作之前应先关掉紫外线灯，关后十多分钟即可入内。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

二、组培实验室常用仪器设备及必要的器皿 常用仪器设备： 1.电子天平 精度高，称量快，但价高。 DT－200 精度0.1g Max 200g 1.电子天平　精度高，称量快，但价高。　　 DT－200 精度0.1g 　Max 200g 　　　　　　　　 用于称取蔗糖和琼脂等 FA1004 精度0.1mg Max 100g 　　　　　 用于称取微量元素和植物激素及微量附加物 ２.高压蒸汽灭菌锅　　 是最基本的设备，用于培养基.器械等的灭菌．　　上海申安　LDZX-40BI 　立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

二、组培实验室常用仪器设备及必要的器皿 3.烘箱　洗净后的玻璃器皿，如需迅速干燥，可放在烘箱内烘干，温度以80-100℃为宜。若需干热灭菌，温度升高至150-160 ℃,持续1-3小时即可。 4.冰箱　某些试剂．药品和母液需低温保存，有些材料需低温处理，需要使用冰箱。 5. 酸度计 培养基中的PH值十分重要,因此配制培养基时,需要用酸度计来测定和调整.一般用小型酸度测定仪,即可在配制培养基时使用,也可测定培养过程中PH 值的变化.若不做研究,仅用于生产,也可用PH值为4-7的精密试纸来代替.测定培养基PH值时,应注意搅拌均匀后再测. 　 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

二、组培实验室常用仪器设备及必要的器皿 6. 超净工作台最常用.最普及的无菌操作装置。 7.光照培养箱及生化培养箱用于植物材料的特定培养。 8.显微镜一般用双筒实体显微镜较多,用于剥取茎尖.以及隔瓶观察内部植物组织生长情况.也还要有生物显微镜.最好配有数码照相机. 9.蒸馏水器水中常含有无机和有机杂质,如不除去,势必影响培养效果.植物组织培养中常使用蒸馏水或无离子水. 10.空调机夏季。 11.振荡培养机和旋转培养机 植物组织培养中有时需要液体培养,液体培养可分为液体静置培养和液体振荡培养.后两种培养方式需要有振荡培养机和旋转培养机. 12.培养架。 13.微波炉配制药品。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

二、组培实验室常用仪器设备及必要的器皿 ㈠.玻璃器皿 ㈡金属器械 1．镊子类 包括小型尖头镊子。16cm-25cm长的枪状镊子等。 必要的器皿： ㈠.玻璃器皿 ㈡金属器械 1．镊子类 包括小型尖头镊子。16cm-25cm长的枪状镊子等。 2．剪刀类 常用的有眼科剪、手术剪、弯头剪等。 3．分离器械 植物材料的分离、切割、和嫁接，要使用解剖刀和芽接刀。前者可用眼科刀和菱形刀代替。刀具液可用双面刀片，旧刚锯条等自制。 4．过滤器械 5．接种针用来转移细胞和愈伤组织。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

三、植物培养技术中的一些一般技术 ㈠器皿的清洗 植物组织培养最重要的，也是最基本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过程中最经常、最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

㈡组培过程中实验设施的灭菌消毒 1.操作人员须换经灭菌的工作服，戴口罩。进入接种室前，工作人员的双手必须进行灭菌，用肥皂水洗涤能达到良好的效果，进行操作前再用70％的酒精擦洗双手。 2.操作期间经常用70％的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。 3.在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内。解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

㈡组培过程中实验设施的灭菌消毒 4.工具用后及时灭菌，避免交叉污染。 5.工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话，并戴上口罩。 6.由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊子等用具，一般在使用前浸泡在75％酒精中，用时在火焰上灭菌，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具灭菌。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

㈡组培过程中实验设施的灭菌消毒 如果实验需要并且条件允许，可以对实验器皿进行高压灭菌。 高压灭菌的原理是： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.11MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。　　 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到 0.11MPa时，开始计时，维持压力0.1～0.15MPa，20min。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

㈢外植体灭菌消毒 外植体在接种之前，须经严格地灭菌。由于灭菌剂的种类不同，杀菌力不同，因此选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，且不会损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长。在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

㈢外植体灭菌消毒 表1.常用的消毒剂 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

㈢外植体灭菌消毒 污染的发生与培养植物的基因型、外植体来源、分离季节、组织大小及操作人员的技术水平等有关。取材组织越大越易污染，夏季取材比冬季取材带菌多，不同年份的污染情况也有所差异。 组织培养中要获得无菌材料，在综合上述情况的基础上，还要选择适宜的消毒剂。由于不同植物及同一植物不同部位，有其不同的特点，它们对不同种类及其浓度的消毒剂敏感反应也不同，所以开始要预备实验，以达到最佳的消毒效果。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

㈢外植体灭菌消毒 外植体灭菌消毒的一般步骤 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

㈢外植体灭菌消毒 外植体灭菌消毒注意事项： 一般情况下，如果外植体较大而且硬，可直接用消毒剂处理，如果实、叶片、茎段、种子等的消毒； 如果是幼嫩的茎尖，一般先取较大的茎尖，表面消毒后，再在无菌条件下借助解剖显微镜取出需要的茎尖大小培养； 如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、花药等，一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒，再在无菌条件下剥出需要的外植体；如果是细胞，应按培养目的，选择合适的起始材料进行相应的外植体消毒。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均需无菌操作。 ㈢外植体灭菌消毒 外植体的接种： 是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均需无菌操作。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

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【思考题】 1.常用的外植体灭菌消毒剂有哪些？ 2.高压灭菌的原理是什么？ 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

天平 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

压力蒸汽消毒器 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

电热干燥箱 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

冰箱 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

培养箱 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

倒置显微镜 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

自动三重纯水蒸馏器 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

超纯水装置系统 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

摇床 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

培养瓶 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0