13下游加工过程概论 生物工程系 吴蕾

本课程主要内容 13 生物下游加工过程概论 14 发酵液的预处理和固液分离方法 15 细胞破碎 16 沉淀法 17 膜分离技术 18 溶剂萃取法 19 双水相萃取 20 吸附法 21离子交换法 22 液相色谱法 23 亲和分离技术 24 结晶法 25 基因工程药物生产实例

主要参考书 《生化分离工程》严希康 编著，化工业出版社 《生物分离原理与技术》欧阳平凯 编著，化工业出版社 《新编生物工艺学》，俞俊棠主编，化工出版社，2003 《生物分离工程》（第二版），孙彦编著，化工出版社，2005 《生物工程下游技术》（第二版），刘国诠主编，化工出版社，2003 《生化分离工程》严希康 编著，化工业出版社 《生物分离原理与技术》欧阳平凯 编著，化工业出版社

成绩 平时成绩占30%，包括平时作业、课堂(提问,点名)等。 期末考试占70%，闭卷考试方法总成绩:平时(30%)+期末(70%)。

13.1 下游加工过程在生物技术中的地位 下游加工过程是生物工程的一个重要组成部分. 发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程称为下游加工过程(downstream processing) 它由一些化学工程的单元操作组成,但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作在一般化学工业中应用较少。

在发酵产品的生产中，分离和精制过程所需的费用占成本的很大部分。 对传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部分占整个工厂投资费用的60％， 对重组DNA生产蛋白质、精制的费用可占整个生产费用的80％一90％。

从第一个基因工程药物，人胰岛素在1982年投产后，人们逐渐认识到下游加工过程的落后有可能会阻碍生物技术的发展，特别是当有其他生产方法与其相竞争时。 英国政府工业部，于1983年发起生物分离计划(BIOSEP)，专门研究下游加工过程，有7个国家、50家公司参加。1987年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议。 美国United Engineering Foundation 从1981年开始连续召开了生物产品回收的会议。 我国也于1989年在济南召开了一次专门会议。人们逐渐取得了共识；现代生物技术的发展是和下游技术的进步紧密相关的。

13.2 传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较 13.2 传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较 1.生化产品的类型 按用途分类 食品类。 保健品类。 医用类产品（1998年，719种）。抗生素112种 农业用产品（1998年，36种）。 生物试剂类（1998年，975种）。 按分子量大小分类 Mass < 1000D：抗生素、有机酸、、多肽类等 Mass > 1000D：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类 按发酵时目的产物所在的位置分类 cell内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 cell外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（α-淀粉酶）等

2.传统生化产品和基因工程产品在提取和精制上的差异 传统生化产品都为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高、提取方法较简单)．其理化性能(如平衡关系等)数据都为已知，因此放大比较有根据；基因工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。

由于第一代基因工程产品都以E.coli作为宿主，表达产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞内物质释放出来，给提取增加了很多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定(易失活，如对剪切力)，故提取较困难。 大分子(蛋白质)的分离主要困难在于杂蛋白的分离，由于蛋白质都内氨基酸所构成，所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法，如色谱分离等。

3. 分离效率的评价 浓缩率（富积率，concentration factor） 3. 分离效率的评价 浓缩率（富积率，concentration factor） 原料(Raw material) 分离器 产品(Product) FW, VW, cT,W, cX,W    废液(Waste fluid) 意义：1）如mT >1，则目标产物得到富积；2）如mT = mX，则目标产物未得到分离纯化。

分离因子(separative factor)，或分离系数(separative coefficient) B、 = 1时，则未分离。故在分离为主要目的时,   此式在单级平衡蒸馏中相当于相对挥发度；在萃取分离中又称为萃取的选择性(selectivity) 比活的定义：在一定条件下，单位质量(mg)的酶在给定的时间内分解底物的umol数[in U/mg]

纯化因子(purification factor) 回收率(recovery)： 纯化因子(purification factor) 对于具有生物活性的蛋白质或酶，常常用分离前后目标产物的比活 A [in U/mg]之比表示目标产物的分离纯化程度，

13.3 生化产品及加工过程的特点 1)应用面广。 医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等 2)种类繁多。分子量X0–X000000，结构功能复杂，生物活性各异。 3)目的产物在初始物料中的含量低。 青霉素（4.2%）、庆大霉素（0.2%）、干扰素（<50ug/ml）。

原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离过程成本越大。 4)产品价格与产物浓度呈反比 原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离过程成本越大。

5)初始物料成分复杂,常需多个步骤,产品总收率低。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。

6)生物活性物质的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。 7)产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原 --- 青霉噻唑蛋白必须控制RIA值（放射免疫测定）小于100（1.5*10-6），蛋白类药物（杂质 < 2%）、重组胰岛素中杂蛋白小于0.01%。

13.4生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作 动、植物组织、体液等 胞外产物 提取 发酵液 → 预处理 → c分离 → c破碎 → 碎片分离 → 初步纯化 → 精制 → 制成品 培养液 加 热 沉 淀 匀 化 离 心 沉 淀 分子筛 无菌过滤 酶反应液 调 pH 离 心 超 声 萃 取 吸 附 离 子 超 滤 絮 凝 过 滤 胞 溶 过 滤 萃 取 亲 和 冻 干 错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤 吸 附 喷 干 憎 水 结 晶 电 泳 发酵液预处理 细胞破碎 初步纯化 高度纯化

13.6 纯化方法选择的基本原则 1)尽可能简单、低耗、高效、快速。 反面例子 ---- 中药现代化、超临界萃取； 正面例子 2)分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。 A) 分离步骤越多，回收率越低；如Y10 = 0.9510 = 0.63，Y5 = 0.955 =0.77 B)分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长

3)避免相同原理的分离技术多次重复出现 分子筛和超滤技术按分子量大小分离，重复应用两次以上，意义就不大了。 4)尽量减少新化合物进入待分离的溶液。 A)引起新的化学污染；B)蛋白质的变性失活   5)合理的分离步骤次序。 原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。 1)、：反面例子 ---- 中药现代化、超临界萃取； 正面例子 ---- 技术的发明和应用 2)、：A）、分离步骤越多，回收率越低；如φ10 = 0.9510 = 0.63，φ5 = 0.955 =0.77； B）、分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长。 3)、：

13.7 纯化流程设计前应了解的信息 要掌握的产物物化性质，主要包括： (1)、溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等； (2)、分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义； (3)、沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义； (4)、极性大小； (5)、分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等； (6)、功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据； (7)、免疫原性。设计亲和色谱； (8)、稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素低pH不稳定)； (9)、分子的淌度及影响因素，包括pH值、离子强度和盐等； (10)、等电点pI； To (8) 淌度：m2 s-1 V-1

成品规格（或产品质量标准） 表1.3 五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页） 指标名称 指标 表1.3 五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页） 指标名称 指标 含量（C37H49N7O9S） 97.0-103.0 比旋光度 -25˚ ~ -29˚ 吸收值比 A(280nm):A(288nm) = 1.12-1.22 氨基酸 各氨基酸之比为1 干燥失重，% 0.5  进料的组成和物性 (1)、目的产物的浓度。高？低？ (2)、物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。 (3)、目的产物的定位。是胞内还是胞外？ (4)、菌种的种类和形态。 (5)、微生物的含量和发酵液的黏度。

生产规模 危害性 分批分离还是连续纯化 (1)离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。 (2)目的产物本身的危害性；抗肿瘤代谢类药物，类固醇类抗生素，激素类药物等。 (3)试剂危害。萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。 (4)微生物的危害。重组DNA工程菌不能任意排放。这一菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。 分批分离还是连续纯化 生产规模不仅对发酵阶段的生产能力提出要求，同时也对分离阶段的生产能力作出了规定。一般而言，规模决定分离提取设备型号（即生产能力），但不规定分离技术基本原理和顺序。为满足大的生产规模，可采用大型号设备，或同种多台设备同时使用。

13.8非蛋白质类杂质的去除 在纯化过程中，三种可能存在的非蛋白质类杂质需要特别注意，它们是DNA、热原质和病毒。 DNA的除去 热原的除去：细菌内毒素 病毒的除去

13.9目标蛋白质的表征和分析方法 蛋白质在分离、纯化过程个易发生变化，因此得到的产品应与已知标准品对照，证明为同一物质并检查其纯度。为达此目的，仅用一种分析方法是不够的，常需用几种方法。 ①HPLC选用基于个同原理的两种层析系统(如反相层析和离子交换层析)，如只得到单个对称峰则表明纯度较高； ⑦聚丙烯酰胺凝胶电泳(PALE)和等电聚焦； ⑤顺序分列N·端和C端顺序分析可用来表征蛋白质： ④其他分析，如氨基酸分析、肽图、免疫化学分析等可进一步提供产品纯度达到均质(homogeneity)和标准品一致的证明。

13.10 发展趋向 操作集成化 方法集成化 大分子与小分子分离方法的相互渗透 亲和技术的推广使用和亲和配基的人工合成 优质亲和层析介质的开发 基因工程对下游过程的影响 发酵与提取相耦合

思考题 下游加工技术的定义。 下游加工过程的特点。 浓缩率，分离因子，回收率，纯化因子的概念及表达式。