组会报告 纤维素酶深层发酵的研究 王美玲 天津大学化工学院 2012-4-11 --指导老师：卢文玉

一、国内外纤维素酶研究现状 二、菌种遗传性状改造研究 三、生产工艺的研究 四、纤维素酶的发酵中试及产业化放大试验

一、国内外纤维素酶研究现状 我国纤维素酶的研究开始于于20世纪60年代初，20世纪90年代初，首条年产2000t纤维素酶生产线投产，我国成为继美国、日本、丹麦之后第四个能生产纤维素酶的国家【1】。 目前国内外研究如何使木霉高产纤维素酶，主要是通以下这些方面: ①、从适合木霉生长的自然环境中筛选高产菌株。 ②、通过化学和物理等复合诱变方式筛选出高产突变株。 ③、通过生产工艺的改进，包括固体发酵和液体发酵，尤其是对液体深层发酵方式的进一步优化提高木霉的产酶量。 ④、消除发酵产酶过程中的纤维二糖和葡萄糖的阻遏抑制效应。

⑤、寻找提高木霉细胞膜通透性的表面活性剂促使纤维素酶这种胞外酶向胞外扩以及添加产酶促进剂。 ⑥、改造纤维素的分子结构，增加其诱导木霉产生纤维素酶的灵敏性。 ⑦、由于目前纤维素酶的酶解效率不高，纤维素酶高产菌木霉普遍存在菌种退化现象，诱变后的高产菌株遗传特性不稳定，因此影响了其工业化生产和广泛应用。 野生菌种产生的纤维素酶活性不高，分解纤维素的能力也较差，产酶比例不协调，产量低，生产成本高，生产周期长等问题影响了我国纤维素酶工业的发展，与世界先进水平相比差距很大，与工业化生产的要求还有一定距离【2】。

二、菌种遗传性状改造研究 提高纤维素酶产品产量和质量的关键之一在于对生产菌里氏木霉的遗传性状进行改造，获得高产和遗传性状稳定的菌株。目前，在该菌种选育中仍然以常规诱变方法作为改变菌种不良性状、提高产量的有效手段。常规诱变主要包括随机筛选和理性筛选两种方法。对该菌的理性筛选方法主要包括耐碳源分解代谢物阻遏突变株的定向筛选【葡萄糖、2—DOG】、耐自身终产物突变株的定向筛选。 例如：紫外诱变，紫外和氯化锂复合诱变，硫酸二乙酯诱变，甲基磺酸乙酯诱变，UV和亚硝基胍诱变复合诱变[14]，硫酸二乙酯和氯化锂复合诱变，太空诱变[3]、微波[4]、60Co、γ及137Cs 诱变等结合原生质体融合技术[5]，并且都取得了一定的进展，有效的提高了多杀菌素的产量。

三、生产工艺研究 纤维素酶的生产和其它酶制剂一样，主要有固体发酵和液体深层发酵两种。固体发酵法是以玉米等农作物秸秆为主要原料，其投资少，工艺简单，产品价格低廉，目前国内绝大部分纤维素酶生产厂家均采用该技术生产纤维素酶。最近国外有人提出混合微生物发酵法是解决纤维素酶系均衡性的新途径，利用不同真菌的纤维素酶系在各组分均衡性方面有互补的现象，将2种甚至2种以上的真菌混合在一起发酵，寻求均能大量分泌纤维素酶的发酵方法和工艺条件，生产出优质高效混合纤维素酶系[6][7]。

但是以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶很难提取、精制，采用液体发酵法生产纤维酶素是必然趋势。目前，针对纤维素酶的液体发酵条件优化研究，主要集中在通过单因素实验或正交实验、响应面试验等数学统计方法进行发酵培养基或培养条件优化。生产纤维素酶的培养基有机碳的主要来源有二：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质的原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料，还有微结晶纤维素、纸浆、堆肥、石油产品中12～16碳的成分等。 里氏木霉的最适氮源是硫酸铵和谷氨酸钠。影响纤维素酶产量及酶活的营养盐有：氮、镁、钠、磷、铁和锰等,用玉米浆提供产酶所需的生长因子。纤维素酶是一种诱导酶，其合成受到纤维素等诱导剂[8][9]的诱导作用。纤维素酶的形成和分泌受到表面活性剂[10]、抑制剂种类及浓度的影响。木霉发酵产纤维素酶的最佳温度为27-28℃。里氏木霉发酵产纤维素酶的最佳pH为5.5-6.0。对于间歇发酵通常是将初始培养介质的pH控制在5.0-6.0。里氏木霉纤维素酶受介质中纤维二糖、葡萄糖等终产物分解代谢阻遏效应的影响。一般阻遏效应是纤维二糖最强,葡萄糖次之。

天然的植物纤维素原料，要通过一定的预处理方法降低其结晶度，增加可及度，从而提高其利用效率。常用的预处理方法物理法、物理-化学法、化学法、生物法以及各种方法的组合对纤维素酶的产量也产生很大的影响。 生物反应动力学模型的研究可以深入了解生产菌种的生长规律，以及菌体生长、底物消耗和产物生成的关系。从工业化生产角度来看，可以在模型指导下，寻找最优操作条件，优化和控制反应器，从而在实际生产中获得较高的底物转化率、发酵生产强度和产物浓度等。目前，对纤维素酶发酵动力学的研究很少[11]。

四、纤维素酶的发酵中试及产业化放大试验 发酵培养：以10L发酵罐为例，10 L罐中装有6.5 L发酵培养基，种子接种量为5%，培养温度30℃，培养时间为6d。控制通气量为0.2～1 vvm ,用调频装置调整转速，为120～150 r/ min ,并通过流加2 mol/ L 氨水控制发酵液pH 大于4.0;通过控制风量和转速,保持适当的溶氧饱和度,并通过流加消泡剂控制发酵过程中形成的泡沫[21]。添加表面活性剂[19]Tween 80（0.6%-1%）有利于提高酶的稳定性和催化能力。此外添加适量的产酶促进剂槐糖[13]、乳糖或乳糖酸[16]刺激纤维素酶的产生。采用SAS系统分析软件（Plackett-Burman和Box-behnken设计），以产物发酵单位和菌体生物量为考核指标，在发酵罐上对培养基成分、接种量、发酵周期、溶氧、温度、pH等进行优化；基于发酵动力学参数（μx, μs和qp）变化特征，结合产抗特性考察分阶段控制模式（溶氧、温度、pH）、底物及底物流加对发酵单位的影响；通过单因子效应评价体系确定菌种生长和产物生成的发酵抑制因子；开展菌体高密度培养技术、底物碳氮源和底物流加发酵技术的组合优化，确定适宜操作条件。

参考文献 [1]窦全林，陈刚.纤维素酶的研究进展及应用前景。畜牧与饲料科学，2006，5:58-60。 [2]陈阿娜，汤斌.纤维素酶高产菌株选育研究进展。安徽农学通报，2006，12(10):640[3]田兴山，张玲华.木霉的空间诱变效应。核农学报，2005，19(3):195-197。 [3]Xing-hua Lia, Hua-junYang, Enhanced cellulose production of the Trichoderma viride mutated by microwave and ultraviolet ；Microbiological Research 165 (2010) 190-19 [4] V.R. Prabavathy, N. Mathivanan; Intra-strain protoplast fusion enhances carboxymethyl cellulase activity in Trichoderma reesei; Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 719–723 [5] P. Chand, A. Aruna, Novel mutation method for increased cellulase production, Journal of Applied Microbiology 2005, 98, 318–323[6] Y.H. Yang, B.C. Wang .Research on solid-state fermentation on rice chaff with a microbial consortium; Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 34 (2004) 1–6 [6] R.Dueas,R.P.Tengerdy,M.Gutierrez-Correa.Cellulase production by mixed fungi in solid-substrate fermentation of bagasse[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology(Historical Archive),1995,11(3):333-337

[8]上海植物生理研究所纤维素酶组.国外纤维素酶研究概况.应用微生物.1975,2：5～14 [9]王冬,曲音波等.L-山梨糖提高木霉纤维素酶合成速率机制的研究.真菌学报.1995,14（2）：143～147 [10] Reese ET,Manguire A. Surfactants as stimulants of enzyme production by microorganisms[J]. Appl Microbiol,1969,17:242～245 [11] Muthuvelayudham, R.; Viruthagiri, T. Optimization and modeling of cellulase protein from Trichoderma reesei Rut C30 using mixed substrate; African Journal of Biotechnology Vol. 6 (1), pp. 041-046, 4 January, 2007 [13] Mfiria Hrmovfi, Peter Biely,Specificity of cellulase andβ-xylanase induction in Trichoderma reesei QM 9414;Arch Microbiol (1986) 144: 307 - 311 [15]Xia Liming;, Shen Xueliang,High-yield cellulase production by Trichoderma reesei ZU-02 on corn cob residue; Bioresource Technology 91 (2004) 259–262 [16] Aftab Ahamed, Patrick Vermette，Effect of culture medium composition on Trichoderma reesei’s morphology and cellulase production；Bioresource Technology 100 (2009) 5979–5987 [17]Md. Zahangir Alam，Statistical optimization of process conditions for cellulase production by liquid state bioconversion of domestic wastewater sludge；Bioresource Technology 99 (2008) 4709–4716

[18] Muthuvelayudham, R. and Viruthagiri, T [18] Muthuvelayudham, R. and Viruthagiri, T. Optimization and modeling of cellulase protein from Trichoderma reesei Rut C30 using mixed substrate;African Journal of Biotechnology Vol. 6 (1), pp. 041-046, 4 January, 2007 [19] Chiyomi Mizutani, Kandan Sethumadhavan, Effect of a nonionic surfactant on Trichoderma cellulase treatments of regenerated cellulose and cotton yarns