紫外-可见分光光度计介绍 生化系：童 丹 2014年3月25日

工作原理 利用一定频率的紫外-可见光照射被分析的物质，引起分子中价电子的跃迁，它将有选择地被吸收，吸收程度随波长而变化，即形成某一物质的吸收光谱。 丙酮

A = lgI0 / I=－lgT =KLc 在紫外-可见光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度。 理论依据：朗伯比尔定律 A = lgI0 / I=－lgT =KLc 单色光 I0 I L

功能与应用 ②判断共轭状态 1.定性分析 ①判断异构体 紫外吸收光谱的重要应用在于测定共轭分子。共轭体系越大，吸收强度越大，波长红移。 可以判断共轭生色团的所有原子是否共平面等。如二苯乙烯（CH＝CH-phe）顺式比反式不易共平面，因此反式结构的最大吸收波长及摩尔吸光系数要大于顺式。顺式:λmax=280nm，k=13 500；反式:λmax=295nm，k =27000。 ③已知化合物的验证 与标准谱图比对，紫外-可见吸收光谱可以作为有机化合物结构测定的一种辅助手段。

2.单组分定量分析 紫外-可见吸收光谱是进行定量分析最广泛使用的、最有效的手段之一。尤其在医院的常规化验中，95%的定量分析都用此法。其用于定量分析的优点是： ①可用于无机及有机体系。 ②一般可检测10－4～10－5mol/L的微量组分，通过某些特殊方法（如胶束增溶）可检测10－6～10－7mol/L的组分。 ③准确度高，一般相对误差1%～3%，有时可降至百分之零点几。

3.混合物分析 5.络合物结合比的测定 4.平衡常数测定 据吸光度的加和性，测定混合物中n个组分的浓度，可在n个不同波长处测量n个吸光度值，列出n个方程组成的联立方程组。 4.平衡常数测定 在化学平衡研究、分子识别中常常用于测定酸解离常数、pH、氢键结合度等。 5.络合物结合比的测定 通过紫外-可见吸收光吸收光谱的测定，可以求得主客体络合物的结合比。常用方法有：摩尔比法、连接变换法或Job法、斜率比法、B-H议程（Benesi-Hildbrand Method）等。

定量分析的方法 1.工作曲线法 2.系数法 3.单标样法 光度测量 功能扩展 系统应用

1 2 3 4 5 样品 标液 C1 C2 C3 C4 C5 CX A A1 A2 A3 A4 A5 AX A AX C CX 1 2 3 4 5 样品 标液 C1 C2 C3 C4 C5 CX A A1 A2 A3 A4 A5 AX 工作曲线法：测量出已知浓度的一系列标准样品的吸光度，用最小二乘法来建立吸光度和浓度的坐标曲线，再根据坐标曲线来测量未知样品浓度的方法。 A C CX AX

系数法：是工作曲线法的简单应用，它是由系统测量出样品的吸光度值，然后将此数值代入指定的公式计算出样品浓度值的方法。 单标样法：测量一个标准样品的吸光度与坐标零点建立一条工作曲线，以此来测量样品浓度的方法。单标样法也称标准品比较法、单点工作曲线法。

紫外可见分光光度计的主要部件 0.575 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 记录

光源 单色器 提供激发能，使待测分子产生吸收。 钨灯（波长范围320nm～2500nm） 氘灯（波长范围190nm～400nm） 把从光源发射出的连续光谱分为波长宽度很窄的单色光， 包括色散元件、狭缝和准直镜三部分。

检测器是一个光电转换元件，它是测量光线透过溶液以后强弱变化的一种装置。本仪器是硅光电池。 吸收池 分光光度分析中盛放溶液样品的容器，材质通常有玻璃和石英两种，一般无色、透明、耐腐蚀。 检测器 检测器是一个光电转换元件，它是测量光线透过溶液以后强弱变化的一种装置。本仪器是硅光电池。 显示记录系统

紫外可见分光光度计的主要性能指标 波长范围：190nm~1100nm 波长示值误差：±1.0nm仪器可以自动波长校正 透射比示值误差：±0.3% 透射比重复性：≤0.15% 杂散光：≤0.05% 基线平直度：±0.002Abc（1090nm~200nm，预热1h后） 噪声：0%噪声：0.05%；100%噪声：0.15% 漂移：≤0.35%/h 测光范围：吸光度：－0.3Abc~3Abc；透光率：0-200%

操作步骤 初始化 43% 1.样品池电机 OK 2.滤光片 OK 3.光源电机 OK 一、开机自检：依次打开打印机、仪器主机电源，仪器开始初始化；约3min时间初始化完成。 初始化 43% 1.样品池电机 OK 2.滤光片 OK 3.光源电机 OK

初始化完成，仪器进入主菜单界面。 光度测量 功能扩展 系统应用

二、进入光度测量状态：在上图所示状态按 键，进入光度测量界面。 ENTER 光度测量： 0.000 Abc 250nm

三、进入测量界面：按 键进入样品测量界面。 START/STOP 250.0nm －0.002Abc No. Abc Conc

请输入波长： 四、设置测量波长：按 键，在下图界面输入测量的波长，例如需要在460nm测量，输入460，按 键确认，仪器将自动调整波长。 GOTO /λ ENTER 请输入波长：

调整波长完成后如下图 460.0nm －0.002Abc No. Abc Conc

五、进入设置参数：在这个步骤中主要设置样品池。按 键进入参数设定界面，按 键使光标移动到“试样设定”，如图所示。按 键确认，进入设定界面。 SET ENTER 测光方式 数字计算 试样设定

试样室 ：八连池 样池数 ： 2 空白溶液校正 ： 否 样池空白校正 ： 否 六、设定使用样品池个数：按 键使光标移动到“使用样池数”，如图所示。按 键循环选择需要使用的样品池个数。 ENTER 试样室 ：八连池 样池数 ： 2 空白溶液校正 ： 否 样池空白校正 ： 否

七、样品测量：按 键返回到参数设定界面，再按 键返回到光度测量界面。在1号样品池内放入空白溶液，2号样品池内放入待测样品。关闭好样品池盖后按 键进行空白校正，再按 键进行样品测量。测量结束如下图所示。 RETURN RETURN ZERO START/STOP 460.0nm －0.002Abc No. Abc Conc 1- 1 0.012 1.000 2- 1 0.052 2.000

键直到返回到仪器主菜单界面后再关闭仪器电源。 八、测量结束：测量完成后按 键打印数据。如果没有打印机请记录数据。退出程序或关闭仪器后测量数据将消失。确保已从样品池中取出所有比色皿，清洗干净以便下一次使用。按 键直到返回到仪器主菜单界面后再关闭仪器电源。 PRINT RETURN

保养与维护 光源 单色器 正确使用吸收池 工作电压 停止工作时应该注意事项 仪器由专人保管使用 安放位置及环境

谢谢大家 谢谢大家