第十章 吸光光度法 吸光光度法（Absorption Photometry）是一种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法。包括可见吸光光度法、紫外-可见吸光光度法和红外光谱法等。 吸光光度法同滴定分析法、重量分析法相比，有以下一些特点： (一)灵敏度高 吸光光度法测定物质的浓度下限(最低浓度)一般可达1-10-3%的微量组分。对固体试样一般可测到10-4%。如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级。

(二)准确度较高 一般吸光光度法的相对误差为2-5%，其准确度虽不如滴定分析法及重量法，但对微量成分来说，还是比较满意的，因为在这种情况下，滴定分析法和重量法也不够准确了，甚至无法进行测定。 (三)操作简便，测定速度快。 (四)应用广泛 几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。

§10-1 物质对光的选择性吸收 一、光的基本性质 光是电磁波。 其波长、频率与速度之间的关系为： E = hν = hc/ λ §10-1 物质对光的选择性吸收 一、光的基本性质 光是电磁波。 其波长、频率与速度之间的关系为： E = hν = hc/ λ h为普朗克常数，其值为6.63×10-34J·s 二、物质对光的选择性吸收 如果我们把具有不同颜色的各种物体放置在黑暗处，则什么颜色也看不到。可见物质呈现的颜色与光有着密切的关系，一种物质呈现何种颜色，是与光的组成和物质本身的结构有关的。

（一）物质对光产生选择性吸收和原因 （二）物质的颜色与吸收光的关系 从光本身来说、有些波长的光线，作用于眼睛引起了颜色的感觉，我们把人眼所能看见有颜色的光叫做可见光，其波长范围大约在400-760nm之间。实验证明：白光(日光、白炽电灯光、日光灯光等)是由各种不同颜色的光按一定的强度比例混合而成的。如果让一束白光通过三棱镜，就分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光，这种现象称为光的色散。每种颜色的光具有一定的波长范围。我们把白光叫做复合光；把只具有一种颜色的光，叫做单色光。

实验还证明，不仅七种单色光可以混合成白光，如果把适当颜色的两种单色光按一定的强度比例混合，也可以成为白光。这两种单色光就叫做互补色光。如绿光和紫光互补，蓝光和黄光互补，等等。 对固体物质来说，当白光照射到物质上时，物质对于不同波长的光线吸收、透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现出不同的颜色。如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰色；如果物质选择性地吸收某些波长的光，那么，这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定。

对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点(分子或离子)选择性的吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的光透过程度相同，这种物质就是无色透明的。如果只让一部分波长的光透过，其他波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，也就是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色。例如硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色。其实，任何一种溶液．对不同波长的光的吸收程度是不相等的。如果将某种波长的单色光依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度，以波长为纵坐标，以吸光度为纵坐标可以得到一条曲线，叫做吸收光谱曲线或光吸收曲线。它清楚地描述了溶液对不同波长的光的吸收情况。

（三）吸收曲线 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸收曲线或吸收光谱。图10—2是四个不同浓度的KMnO4溶液的光吸收曲线。从图10—2可以看出，在可见光范围内，KMnO4溶液对波长525nm附近的绿色光有最大吸收，而对紫色和红色光则吸收很少。光吸收程度最大处的波长，称为最大吸收波长，常用 λ最大或λmax表示，任何可见光区内、溶液的颜色主要是由这个数值决定的。在正常情况下，选用不同浓度的某种溶液，最大吸收波长也是固定不变的，说明光的吸收与溶液中物质的结构有关。

(cKMnO4: a<b<c<d) 溶液的吸收曲线 (cKMnO4: a<b<c<d)

§10-2 光吸收的基本定律 一、朗伯-比耳定律 （一）朗伯-比耳定律的推导 §10-2 光吸收的基本定律 一、朗伯-比耳定律 （一）朗伯-比耳定律的推导 朗伯(Lambert)和比耳(beer)分别于1760年和1852年研究了光的吸收与有色溶液按层的厚度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析法的理论基础。当一束平行单色光照射到任何均匀、非散射的介质（固体、液体或气体），例如溶液时，光的一部分被介质吸收，一部分透过溶液、一部分被器皿的表面反射。如果入射光的强度为I0，吸收光的强度为Ia，透过光的强度为It,反射光的强度为Ir则它们之间的关系为 I0＝Ir+Ia+It

　在分光光度测定中，盛溶液的比色皿都是采用相同质量的光学玻璃制成的，反射光的强度基本上是不变的(一般约为入射光强度的4％)其影响可以互相抵消，于是可以简化为 I0＝It+Ia 　纯水对于可见光的吸收极微，故有色液对光的吸收完全是由溶液中的有色质点造成的。 　当入射光的强度I0一定时，如果Ia越大，It就越小，即透过光的强度越小，表明有色溶液对光的吸收程度就越大。   　实践证明，有色溶液对光的吸收程度，与该溶液的浓度、液层的厚度以及入射光的强度等因素有关。如果保持入射光的强度不变，则光吸收程度与溶液的浓度和液层的厚度有关。

1. 朗伯定律 -dI = k1Idb logI0/I = K1b 2. 比耳定律 -dI = k2Idc logI0/I = K2c 3. 朗伯-比耳定律 如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化，都影响物质对光的吸收，则上述两个定律可合并为朗伯-比耳定律，即得到：logI0/I = Kbc 令：A = logI0/I 则： A = KbC 此式为光吸收定律的数学表达式。 式中A称为吸光度， K是比例常数，与入射光的波长、物质的性质和溶液的温度等因素有关。 I/I0称为透光率，用T表示。它与A的关系为： A = lg1/T

（二）吸收系数和桑德尔灵敏度 1. 吸收系数 (1) 吸收系数a 当c的单位为g/L，b的单位为cm时,K用a表示，称为吸收系数，其单位为L/g·cm，这时朗伯-比耳定律变为： A＝abc (2) 摩尔吸收系数κ 当式中浓度c的单位为mol/L，液层厚度的单位为cm时，则用另一符号κ表示，称为摩尔吸收系数，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。其单位为L/mol·cm。这时朗伯-比耳定律就变为: A＝κbc

在分光光度分析实践中,我们不能直接取1mol/L这样高浓度的有色溶液来测定摩尔吸光系数值，而是在适宜的低浓度时测定吸光度，然后通过计算求得κ值。 2. 桑德尔灵敏度 吸光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数κ表示外，还常用桑德尔灵敏度S表示。 定义：当光度仪器的检测极限为A=0.001时，单位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量（μg·cm-2）。

由桑德尔灵敏度S的定义可得到： A=0.001=κbc

即： S=M/κ 可见，某物质的摩尔吸光系数k越大，其桑德尔灵敏度S越小，即该测定方法的灵敏度越高。 3.标准曲线的绘制及应用 配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定条件下进行测定。然后以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标作图，得到一条标准曲线，也称做工作曲线。曲线的斜率为κb，由此可得到摩尔吸收系数κ；也可根据未知液的Ax,在标准曲线上查出未知液的浓度cx。

二、引起偏离朗伯-比耳定律的原因 (一)物理因素 1. 单色光不纯所引起的偏离 严格地讲，朗伯-比耳定律只对一定波长的单色光才成立。但在实际工作中，目前用各种方法得到的入射光并非纯的单色光，而是具有一定波长范围的单色光。那么，在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯—比耳定律的偏离。 2. 非平行入射光引起的偏离 非平行入射光将导致光束的平均光程b’大于吸收池的厚度b，实际测得的吸光度将大于理论值。

3. 介质不均匀性引起的偏离 朗伯-比耳定律是建立在均匀、非散射基础上的一般规律、如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态存在，则入射光除了被吸收之外、还会有反射、散射作用。在这种情况下，物质的吸光度比实际的吸光度大得多，必然要导致对朗伯-比耳定律的偏离。

（二）化学因素 1. 溶液浓度过高引起的偏离 朗伯-比耳定律是建立在吸光质点之间没有相互作用的前提下。但当溶液浓度较高时，吸光物质的分子或离子间的平均距离减小，从而改变物质对光的吸收能力，即改变物质的摩尔吸收系数。浓度增加，相互作用增强，导致在高浓度范围内摩尔吸收系数不恒定而使吸光度与浓度之间的线性关系被破坏。 2. 化学变化所引起的偏离 溶液中吸光物质常因解离、缔合、形成新的化合物或在光照射下发生互变异构等，从而破坏了平衡浓度与分析浓度之间的正比关系，也就破坏了吸光度A与分析浓度之间的线性关系。产生对朗伯-比耳定律的偏离。

§10-3 吸光光度法的仪器 一、基本部件 一般由光源、单色器（分光系统）、吸收池、检测系统和信号显示系统等五部分组成。 （一）光源 §10-3 吸光光度法的仪器 一、基本部件 一般由光源、单色器（分光系统）、吸收池、检测系统和信号显示系统等五部分组成。 （一）光源 常用的光源为6-12伏低压钨丝灯，电源由温器供给，为了保持光源强度的稳定，以获得准确的测定果，电压必须稳定。 （二）单色器（分光系统） 单色器的作用是从光源发出的复合光中分出所需要的单色光。 单色器通常由由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦镜和出射缝组成。

（三）吸收池（比色皿） 比色皿是用透明无色的光学玻璃制作的。大多数比色皿为长方形，也有圆柱形的。一般厚度为0.5、1、2和3厘米。 （四）检测系统(光电转化器) 在光度计中，常用的是硒光电池。晒光电池和眼睛相似，对于各种不同波长的光线，灵敏度是不同的。对于波长为500-600nm的光线最灵敏。而对紫外线，红外线则不能应用。 光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计中。具有灵敏度高、光敏范围广及不易疲劳等特点。

（五）信号显示系统 早期使用的是检流计、微安表、电位计、数字电压表、自动记录仪等。 现代的分光光度计广泛采用数字电压表、函数记录仪、示波器及数据处理台等。 测量光电流的检流计常用悬镜式检流计(也称作直流复射式检流计)，其灵敏度可达10-9安培／格。为了保护检统计，使用中要防止震动或大电流通过。检流计标尺上有两种刻度，等刻度的是表示百分透光率(T％)，对数刻度表示吸光度(A)。 根据透光率T，如果把入射光强度IO当作IO光强单位，透过光强度当作100光强单位中的一部分，这一数值为百分透光度，亦称为百分透光率。

二、吸光度的测量原理 分光光度计实际上测得的是光电流或电压，通过转换器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度A。测定时，只要将待测物质推入光路，即可直接读出吸光度值。 测定步骤： 1. 调节检测器零点，即仪器的机械零点。 2. 应用不含待测组分的参比溶液调节吸光零点。 3. 待测组分吸光度的测定。

三、分光光度计的类型 可见分光光度计、紫外-可见分光光度计和红外分光光度计。 (一) 单光束分光光度计 (二) 双光束分光光度计

§10-4 吸光光度法分析条件的选择 一、显色反应及其条件的选择 （一）显色反应和显色剂 1. 显色反应 §10-4 吸光光度法分析条件的选择 一、显色反应及其条件的选择 （一）显色反应和显色剂 1. 显色反应 在分光光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。显色反应可分两大类，即络合反应和氧化还原反应，而络合反应是最主要的显色反应。与被测组分化合成有色物质的试剂称为显色剂。同一组分常可与若干种显色剂反应，生成若干有色化合物，其原理和灵敏度亦有差别。一种被测组分究竞应该用哪种显色反应，可根据所需标准加以选择。

选择显色反应的一般标准 : (1) 选择性要好。一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应，这样干扰就少。或者干扰离子容易被消除、或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰相隔较远。 (2) 灵敏度要高。由于吸光光度法一般是测定微量组分的，灵敏度高的显色反应有利于微量组分酌测定。灵敏度的高低可从摩尔吸光系数值的大小来判断，κ值大灵敏度高，否则灵敏度低。但应注意，灵敏度高的显色反应，并不一定选择性就好，对于高含量的组分不一定要选用灵敏度高的显色反应。

(3) 对比度要大。即如果显色剂有颜色，则有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要大，一般要求在60nm以上。 (4)有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定。有色化合物的组成若不确定，测定的再现性就较差。有色化合物若易受空气的氧化、日光的照射而分解，就会引入测量误差。 (5)显色反应的条件要易于控制。如果条件要求过于严格，难以控制，测定结果的再现性就差。

2. 显色剂 (1)无机显色剂 许多无机试剂能与金属离子起显色反应，如Cu2+与氨水形成深蓝色的络离子Cu(NH4)42+，SCN-与Fe3+形成红色的络合物Fe(SCN)2+或Fe(SCN)63-等。但是多数无机显色剂的灵敏度和选择性都不高，其中性能较好，目前还有实用价值的有硫氰酸盐、钼酸铵、氨水和过氧化氢等。 (2)有机显色剂 许多有机试剂，在一定条件下，能与金属离子生成有色的金属螯合物(具有环状结构的络合物)。

1.大部分金属螯合物都呈现鲜明的颜色，摩尔吸光系数大于104，因而测定的灵敏度很高； 将金属螯合物应用于光度分析中的优点是： 1.大部分金属螯合物都呈现鲜明的颜色，摩尔吸光系数大于104，因而测定的灵敏度很高； 2.金属螯合物都很稳定，一般离解常数都很小，而且能抗辐射； 3.专用性强，绝大多数有机整合剂，在一定条件下，只与少数或其一种金属离子络合，而且同一种有机螯合剂与不同的金属离子络合时，生成具有特征颜色的螯合物。

4.虽然大部分金属螯合物难溶于水，但可被萃取到有机溶剂中，大大发展了萃取光度法。 5.在显色分子中，金属所占的比率很低，提高了测定的灵敏度。因此，有机显色剂是光度分析中应用最多最广的显色剂，寻找高选择性、高灵敏度的有机显色剂，是光度分析发展和研究的重要内容。

在有机化合物分子中，凡是包含有共轭双键的基团如—N＝N—、—N＝O、—NO2、对醌基、＝C＝O(羰基)、＝C＝S(硫羰基)等，一般都具有颜色，原因是这些基团中的л电子被光激发时，只需要较小的能量，能吸收波长大于200nm的光，因此，称这些基团为生色团；某些含有未共用电子对的基团如胺基—NH2，RHN—，R2N—(具有一对未共用电子对)，羟基-OH(具有两对末共用电子对)，以及卤代基—F，—Cl，—Br，—I等，它们与生色基团上的不饱和键互相作用，引起永久性的电荷移动，从而减小了分子的活化能促使试剂对光的最大吸收“红移” (向长波方向移动)，使试剂颜色加深，这些基团称为助色团。

含有生色基团的有机化合物常常能与许多全属离子化合生成性质稳定且具有特征颜色的化合物，且灵敏度和选择性都很高，这就为用光度法测定这些离子提供了很好的条件。 有机显色剂的种类很多，应用较广泛的几种有机显色剂如邻二氮菲、双硫腙、二甲酚橙、偶氮胂III 、铬天青S等。

（二）显色反应条件的选择 1.显色剂的用量 显色就是将被测组分转变成有色化合物，表示： M + R = MR (被测组分) (显色剂) (有色化合物) 反应在一定程度上是可逆的。为了减少反应的可逆性，根据同离子效应，加入过量的显色剂是必要的，但也不能过量太多，否则会引起副反应，对测定反而不利。

2.溶液的酸度 溶液的酸度直接影响着金属离子和显色剂的存在形式以及有色络合物的组成和稳定性。因此，控制溶液适宜的酸度，是保证光度分析获得良好结果的重要条件之一。 (1)酸度对被测物质存在状态的影响 大部分高价金属离子都容易水解，当溶液的酸度降低时，会产生一系列羟基络离子或多核羟基络离子。高价金属离子的水解象多元弱酸的电离一样，是分级进行的。 随着水解的进行，同时还发生各种类型的聚合反应。聚合度随着时间增大，而最终将导致沉淀的生成。显然，金属离子的水解，对于显色反应的进行是不利的，故溶液的酸度不能太低。

(2) 酸度对显色剂浓度和颜色的影响 光度分析中所用的大部分显色剂都是有机弱酸。显色反应进行时，首先是有机弱酸发生离解，其次才是络阴离子与金属离子络合。 M + HR＝MR + H+ 从反应式可以看出，溶液的酸度影响着显色剂的离解,并影响着显色反应的完全程度。当然，溶液酸度对显色剂离解程度影响的大小，也与显色剂的离解常数有关，Ka大时，允许的酸度可大；Ka很小时，允许的酸度就要小些。

许多显色剂本身就是酸碱指示剂，当溶液酸度改变时，显色剂本身就有颜色变化。如果显色剂在某一酸度时，络合反应和指示剂反应同时发生，两种颜色同时存在，就无法进行光度测定。例如、二甲酚橙在溶液的pH＞6.3时呈红色，在pH＜6.3时呈柠檬黄色，在pH＝6.3时，呈中间色，故pH＝6.3时,是它的变色点。而二甲酚橙与金属离子的络合物却呈现红色。因此，二甲酚橙只有在pH＜6的酸性溶液中可作为金属离子的显色剂。如果在pH＞6的酸度下进行光度测定，就会引入很大误差。

(3)对络合物组成和颜色的影响 对于某些逐级形成络合物的显色反应、在不同的酸度时，生成不同络合比的络合物。例如铁与水杨酸的络合反应，当 pH＜4 [Fe3+(C7H4O3)2-]+ 紫色 4＜pH＜9 [Fe3+(C7H4O3)22-]- 红色 pH＞9 [Fe3+(C7H4O3)32-]3- 黄色 在这种情况下，必须控制合适的酸度，才可获得好的分析结果。

3.时间和温度 显色反应的速度有快有慢。显色反应速度，几乎是瞬间即可完成，显色很快达到稳定状态，并且能保持较长时间。大多数显色反应速度较慢，需要一定时间，溶液的颜色才能达到稳定程度。有些有色化合物放置一段时间后，由于空气的氧化，试剂的分解或挥发，光的照射等原因，使颜色减退。适宜的显色时间和有色溶液稳定程度，也必须通过实验来确定。实验方法是配制一份显色溶液，从加入显色剂计算时间、每隔几分钟测定一次吸光度，绘制A-t曲线，根据曲线来确定适宜的时间。

不同的显色反应需要不同的温度，一般显色反应可在室温下完成。但是有些显色反应需要加热至一定的温度才能完成；也有些有色络合物在较高温度下容易分解。因此，应根据不同的情况选择适当的温度进行显色。温度对光的吸收及颜色的深浅也有一定的影响，故标样和试样的显色温度应保持一样。合适显色温度也必须通过实验确定,做A-C曲线即可求出。

4. 有机溶剂和表面活性剂 溶剂对显色反应的影响表现在下列几方面。 （1）溶剂影响络合物的离解度 许多有色化合物在水中的离解度大，而在有机溶剂中的离解度小，如在Fe(SCN)3溶液中加入可与水混溶的有机试剂(如丙酮)，由于降低了Fe(SCN)3的离解度而使颜色加深提高了测定的灵酸度。 （2）溶剂改变络合物颜色的原因可能是各种溶剂分子的极性不同、介电常数不同，从而影响到络合物的稳定性，改变了络合物分子内部的状态或者形成不同的溶剂化物的结果。

（3）溶剂影响显色反应的速度 例如，当用氯代磺酚S测定Nb时，在水溶液中显色需几小时，如果加入丙酮后，仅需30分钟。 表面活性剂的加入可以提高显色反应的灵敏度，增加有色化合物的稳定性。其作用原理一方面是胶束增溶，另一方面是可形成含有表面活性剂的多元络合物。

5. 共存离子的干扰及消除 (1)与试剂生成有色络合物。 (2)干扰离子本身有颜色。如Cu2+(蓝色)。 (3)与试剂结合成无色络合物消耗大量试剂而使被测离子络合不完全。 (4)与被测离子结合成离解度小的另一化合物。

消除干扰的方法主要有以下几种： （1）控制酸度 （2）加入掩蔽剂 （3）采用萃取光度法 （4）在不同波长下测定两种显色配合物的吸光度，对它们进行同时测定。 （5）寻找新的显色反应 （6）分离干扰离子 此外，还可以通过选择适当的测量条件，消除干扰离子的影响。

二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择 光度分析法的误差来源有两方面，一方面是各种化学因素所引入的误差，另一方面是仪器精度不够，测量不准所引入的误差。 （一）仪器测量误差 任何光度计都有一定的测量误差。仪器测量误差主要是指光源的发光强度不稳定，光电效应的非线性，电位计的非线性、杂散光的影响、滤光片或单色器的质量差(谱带过宽)，比色皿的透光率不一致，透光率与吸光度的标尺不准等因素。对给定的光度计来说，透光率或吸光度的读数的准确度是仪器精度的主要指标之一，也是衡量测定结果准确度的重要因素。

光度计主要仪器测量误差是表头透射比的读数误差。光度计的读数标尺上透射比T的刻度是均匀的，故透射比的读数误差ΔT（绝对误差）与T本身的大小无关，对于一台给定仪器它基本上是常数，一般大0.002-0.01之间，仅与仪器身身的精度有关。

（二）测量条件的选择 选择适当的测量条件，是获得准确测定结果的重要途径。择适合的测量条件，可从下列几个方面考虑。 1. 测量波长的选择 由于有色物质对光有选择性吸收，为了使测定结果有较高的灵镀度和准确度，必须选择溶液最大吸收波长的入射光。如果有干扰时，则选用灵敏度较低但能避兔干扰的入射光，就能获得满意的测定结果。

2. 吸光度范围的控制 吸光度在0.15-0.80时，测量的准确度较高。为此可以从下列几方面想办法： （1）计算而且控制试样的称出量，含量高时，少取样，或稀释试液；含量低时，可多取样，或萃取富集。 （2）如果溶液已显色，则可通过改变比色皿的厚度来调节吸光度大小。

3. 参比溶液的选择 参比溶液是用来调节仪器工作零点的，若参比溶液选得不适当，则对测量读数准确度的影响较大。选择的办法是： （1）当试液、试剂、显色剂均无色时，可用蒸馏水作参比液。 （2）试剂和显色剂均无色时，而样品溶液中其他离子有色时，应采用不加显色剂的样品溶液作参比液。

（3）试剂和显色剂均有颜色时，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，然后把显色剂、试剂均按操作手续加入，以此做参比溶液，这样可以消除一些共存组分的干扰。 此外，对于比色皿的厚度、透光率、仪器波长，读数刻度等应进行校正，对比色皿放置位置、光电池的灵敏度等也应注意检查。

§10－5 吸光光度法的应用 一、定量分析 1. 一般方法 A-c标准曲线法 2. 示差法 §10－5 吸光光度法的应用 一、定量分析 （一）单组分的测定 1. 一般方法 A-c标准曲线法 2. 示差法 当被测组分含量高时，常常偏离朗伯-比耳定律。即使不偏离，由于吸光度太大，也超出了准确读数的范围，就是把分析误差控制在5%以下，对高含量成分也是不符合要求的。如果采用示差法，就能克服这一缺点，也能使测定误差降到±0.5％以下。

示差法与普通光度法的主要区别在于它采用的参比溶液不同，它是以一个浓度比试液cx稍小的标准溶液cs作参比，然后再测定试液的吸光度。 As = -lgTs = κbcs Ax = -lgTx = κbcx 实际测得吸光度Af为 Af =Ax – As = κb(cx-cs) = κbΔc cx = cs + Δc 示差法相对普通光度法提高测量准确度的原因是扩展了读数标尺。 需要注意的是示差光度法必须采用专门设计的示差分光光度计。

同时测定一种试样中的多种组分的基础是吸光度具有加合性，即总吸光度为各个组分吸光度的总和。 (二)多组分的同时测定 同时测定一种试样中的多种组分的基础是吸光度具有加合性，即总吸光度为各个组分吸光度的总和。

二、络合物组成和酸碱离解常数的测定 （一）络合物组成的测定 1. 摩尔比法 应用分光光度法可以测定络合物的组成(络合比)和稳定常数。这里简要介绍一下用摩尔比法测定络合物的络合比。 设络合反应为 M + nR ＝ MRn 通常是固定金属离子M的浓度，逐渐增加络合剂的浓度。配位体为R，显然，R应是无色的或在选定的波长范围内无显著吸收。然后稀释至同一体积，得到[R]／[M]为1，2，3……的一系列溶液，配制相应的试剂空白，在一定波长下，测定其吸光度，绘制曲线，用作图法求得络合比。

曲线前部分表示，络合剂R浓度不断增加，生成的络合物不断增多，吸光度逐渐增大。当金属离子M全部形成络合物后，络合剂R的浓度再增加，吸光度达到最大值而不再变化。曲线峰部分转折不明锐、是由于络合物有微小离解造成的。曲线峰两线，交于D点，由D点向横轴作垂线，交于横轴的一点，这点的比值就是络合物的配合化。

2. 等摩尔连续变化法 此法是保持溶液中cM+cR为常数，连续改变cR/cM配制出一系列溶液。分别测量系列溶液的吸光度A，以A对cM/(cM+cM)作图，曲线折点对应的cR/cM值就等于络合比n。 等摩尔连续变化法实用于络合比低、稳定性较高的络合物组成的测定。 此外还可以测定络合物的不稳定常数。

（二）酸碱离解常数的测定 酸和碱的离解常数可用分光光度法测定，离解常数依赖于溶液的pH值。 设有一元弱酸HB，按下式离解： HB = H+ + B- Ka = [B-][H+]/[HB] 配制三种分析浓度c = [HB] + [B-]相等而pH不同的溶液。第一种溶液的pH在pKa附近，此时溶液中HB与B-共存，用1cm的吸收池在某一定的波长下，测量其吸光度：

第二种溶液是pH比pKa低两个以上单位的酸性溶液，此时弱酸几乎全部以HB型体存在，在上述波长下测得吸光度：

第三种溶液是pH比pKa高两个以上单位的碱性溶液，此时弱酸几乎全部以B-型体存在，在上述波长下测得吸光度

将上各式整理得： 上式即为用分度法测定一元弱酸解离常数的基本公式。 三、双波长分光光度法（略）