专题一 传统发酵技术应用 专题二 微生物的培养与应用
知识排查
果酒制作 果醋制作 发酵菌种 酵母菌 醋酸菌 反应式 C6H12O6＋6O2―→6CO2＋6H2O 考点诠解 一、果酒与果醋制作的比较 果酒制作 果醋制作 发酵菌种 酵母菌 醋酸菌 反应式 C6H12O6＋6O2―→6CO2＋6H2O C6H12O6―→2C2H5OH＋2CO2 C6H12O6＋2O2 ―→2CH3COOH＋2CO2＋2H2O C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O 对酸性环境 耐酸性 最适发酵温度 18～25 ℃ 30～35 ℃ 发酵时间 10～12 d 7～8 d 对氧的需求 前期需氧，后期不需氧 一直需氧
1.在果酒制作过程的前期通入空气或在发酵瓶(罐)中留有一定的空间(大约1/3)，可以给酵母菌提供氧气，使其进行有氧呼吸，为酵母菌的生长、增殖提供能量。酵母菌迅速增殖，缩短发酵时间。在产生酒精的阶段要求严格的厌氧环境，此阶段如果有氧，则会抑制酒精发酵。 2．果醋制作过程中要求始终通氧，因为醋酸菌是好氧细菌，缺氧时醋酸菌的生长、增殖都会受到影响。另外醋酸的生成也会受到影响。
3．制作中原料的消毒 (1)榨汁前葡萄的冲洗，应先冲洗再去枝梗，因为在去梗的同时会使一些微生物侵入果实内部，给消毒带来一定的困难。另外对于果酒的自然发酵，冲洗不要反复进行，因为其他杂菌和酵母菌被洗去的机会是均等的，如果冲洗次数过多，使酵母菌数量减少，使发酵周期加长，产生的酒精含量下降。 (2)一般选用体积分数为70%的酒精，并不是酒精的含量越高效果越好，因为含量过高会使细菌周围形成一层菌膜，酒精不易进入细菌体内；70%的酒精可以迅速进入细菌体内，使体内的蛋白质变性，将细菌消灭。
特点提示：(1)果酒制作和果醋制作过程都需要微生物的参与，但二者所需要的条件不同，如对温度、氧的需求。 (2)不同菌体最适发酵温度不同，与酶的最适温度不同有关。
4．用重铬酸钾来检测酒精时的对照实验 根据对照实验的原则，在单一变量的前提下，用重铬酸钾检测发酵液中生成酒精的方法。 对照组试管中加入2 mL白酒，实验组试管中分别加入2 mL发酵前和发酵后的果汁，再分别加入物质的量浓度为3 mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察。
1．泡菜的制作 按照清水与盐的质量比为4∶1的比例配制盐水。将盐水煮沸冷却。将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛内，装至半坛时，放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满，再徐徐注入配制好的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。在坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。在发酵过程中要注意经常补充水槽中的水。发酵时间长短受室内温度的影响。
2．测定亚硝酸盐含量的操作中有关的几个问题 (1)实验原理：亚硝酸盐遇到对氨基苯磺酸溶液和N1萘基乙二胺盐酸盐溶液时会呈现玫瑰红色。亚硝酸盐溶液的浓度不同，呈现的颜色深浅不一，溶液浓度高，颜色深些；浓度低，颜色浅些。 (2)药品：质量浓度为4 mg/mL的对氨基苯磺酸溶液、质量浓度为2 mg/mL的N1萘基乙二胺盐酸盐溶液、质量浓度为5 μg/mL的 NaNO2溶液(再配制成不同浓度，作为标准显色液)、提取剂(酸性条件下的氯化镉和氯化钡溶液)、Al(OH)3乳液、物质的量浓度为2.5 mol/L的 NaOH溶液。 (3)制备样品处理液时，氢氧化铝乳液的作用是吸附样品滤液中的杂质，使滤液变得无色透明，以便于观察颜色变化。
特别提醒：泡菜腌制过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化 (1)发酵初期：以不产酸的大肠杆菌和酵母菌活动为主，同时，还有一部分硝酸盐还原菌活动。该时期利用了氧气，产生了厌氧环境，乳酸菌才开始活动。乳酸菌和乳酸的量都比较少，而由于硝酸盐还原菌的活动，亚硝酸盐含量有所增加。
(2)发酵中期：由于乳酸菌产生了大量乳酸，其他细菌活动受到抑制，只有乳酸菌活动强烈。此期乳酸菌数量达到高峰，乳酸的量继续积累。由于硝酸盐还原菌活动受抑制，同时形成的亚硝酸盐又被分解，因而亚硝酸盐含量下降。所以亚硝酸盐在整个发酵过程中的含量变化趋势如下图： (3)发酵后期：由于乳酸的积累，酸度继续增长，乳酸菌活动也受到抑制。乳酸菌数量下降，而硝酸盐还原菌完全被抑制。
三、微生物的营养及培养基的类型 1．微生物的营养及功能 微生物的化学组成与其他生物大体相同，也是由C、H、O、N、P、S等元素组成的，其中C、H、O、N占细胞干重的90%以上，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物。这些化合物归纳成碳源、氮源、生长因子、水和无机盐这五大类营养要素。
营养 物质 定义 作用 主要来源 碳源 凡能提供所需碳元素的物质 构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机化合物：CO2、NaHCO3；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等 氮源 凡能提供所需氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：NH3、铵盐、硝酸盐；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等 生长 因子 生长必不可少的微量有机物 酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基等 水 在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高 不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定 － 无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质某些化能自养菌的能源，酶的激活剂
(1)微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。 (2)在微生物所需要的化合物中需要量最大的是碳源，新陈代谢同化作用类型的划分可以利用的碳源类型为依据，能利用无机碳源的为自养型，反之则为异养型。 (3)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源又是氮源和能源。 (4)微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。一些天然物质如酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等可为微生物提供生长因子。
(5)自养型微生物和异养型微生物的营养比较 营养型 碳源 氮源 生长因子 举例 自养型微生物 CO2、NaHCO3 NH3、铵盐、硝酸盐等 一般不需要 硝化细菌 异养型微生物 糖类、脂肪酸等 铵盐、硝酸盐、蛋白质等 有些种类需要 乳酸菌
2.培养基的类型比较
划分标准 培养基种类 特点 用途 化学 成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 合成培养基 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成) 分类、鉴定 选择培养基 培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐) 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
注意：病毒为非细胞结构生物体，专营活细胞寄生，目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增殖。常用于培养病毒的是活鸡胚。
仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 四、微生物培养中几种实验操作技术 1．无菌技术 (1)消毒和灭菌的区别： 条件 结果 常用的方法 消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法(如100 ℃煮沸5～6 min可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢)、巴氏消毒法、化学药剂消毒法 灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内处所有微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中试管口或瓶口等 (2)几种常用灭菌和消毒方法的比较： 灭菌和消毒种类 主要方法 应用范围 灼烧灭菌 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中试管口或瓶口等 干热灭菌 干热灭菌箱160～170 ℃加热1～2 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品 高压蒸汽灭菌 100 kPa、121 ℃维持15～30 min 培养基及多种器材、物品
灭菌和消毒种类 主要方法 应用范围 巴氏消毒法 70～75 ℃煮30 min或80 ℃煮15 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体 间歇灭菌法 100 ℃下蒸煮 30～60 min连续重复3 d，每天1次 含有葡萄糖或氨基酸等不耐高温药品的培养基等 蒸汽持续灭菌法 100 ℃持续加热15～30 min 微生物制品的土法生产或食用菌菌种制备 紫外线消毒 30W紫外灯照射30 min 接种室空气 化学药物消毒 用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等 用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒、空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
特别提醒：(1)酒精消毒时，体积分数为70%的酒精杀菌效果最好，原因是浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。 (2)消毒时一般不能杀死微生物的芽孢的原因是：芽孢是细胞内形成的一个圆柱形或椭球形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，它抗热、抗化学药物、抗静水压能力极强，一般细菌的营养细胞不能经受70 ℃以上高温，但芽孢有惊人的耐高温能力。
2．倒平板 (1)培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板。 (2)左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开。 (3)整个操作在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。 (4)平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。 (5)若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，这个平板应丢弃。
杀死上次画线结束后接种环上残留的菌种，使每次画线的菌种来自上次画线末端 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 3．平板画线操作 (1)第一次画线及每次画线之前都需灼烧接种环进行灭菌，画线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表： 第一次灼烧 每次画线之前灼烧 画线结束后灼烧 目的 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 杀死上次画线结束后接种环上残留的菌种，使每次画线的菌种来自上次画线末端 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
(2)灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。 (3)画线时最后一区域不要与第一区域相连。 (4)画线用力要大小适当，防止用力过大将培养基画破。
4．稀释涂布平板 (1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。 (2)涂布平板时： ①涂布器用70%酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。 ②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。 ③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管头不要接触任何物体。
热点突破 题型一 果酒、果醋制作原理及过程 典例1 低度的果酒、果醋具有一定的保健养生功能。下图是两位同学制果酒和果醋时使用的装置。同学甲用A(带盖的瓶子)装置制葡萄酒，在瓶中加入适量葡萄汁，发酵温度控制在18～25 ℃，每隔12 h左右将瓶盖拧松一次(注意不是打开瓶盖)，之后再将瓶盖拧紧。当发酵产生酒精后，再将瓶盖打开，盖上一层纱布，温度控制在30～35 ℃，进行果醋的发酵。同学乙用B装置，温度控制与甲相同，不同的是制果酒阶段除充气口用夹子夹紧外，排气的橡胶管也用夹子夹住，并且每隔12 h左右松一松夹子放出多余的气体。制果醋阶段适时向充气口充气。经过20 d左右，两位同学先后完成了自己的发酵制作。据此回答有关问题：
(1)从制酒和制醋两阶段对装置的处理方式判断，酵母菌和醋酸杆菌的异化作用类型依次是________________。 (2)同学甲在制酒阶段，每隔12 h左右就要将瓶盖拧松一次，但又不打开，这样做的原因是________________________________。用反应式表示出制酒过程刚开始时发生的主要化学变化：________。
(3)B装置中排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连，这样做的原因是__________。 (4)制葡萄酒时要将温度控制在18～25 ℃，而制葡萄醋时要将温度控制在30～35 ℃，目的是__________________。葡萄汁为酵母菌、醋酸杆菌等微生物的生长提供的营养成分是_______________________。 (5)制作过程一般不需要额外添加酵母菌和醋酸杆菌即可完成。为了提高果酒品质也可以在果汁中加入人工培养的酵母菌。利用__________培养基可分离获得较为纯净的酵母菌菌种。制作果醋时也可直接在果酒中添加优质醋酸杆菌菌种，处于__________期的细菌最适宜作为生产菌种。
解析：酒精发酵后期产生大量CO2，将瓶盖拧松是为了放出CO2，但又不打开，这是为了防止氧气和有害杂菌进入。需用选择培养基从众多的微生物中筛选出有用的酵母菌。
题型二 泡菜的制作及亚硝酸盐含量的测定 典例2 如图是泡菜的制作及测定亚硝酸盐含量的实验流程示意图，请据图回答：
(1)制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜或其他原料，原因是_________。 (2)制作泡菜的盐水中清水与盐的质量比约为__________，盐水需煮沸并冷却后才可使用，原因是________________________；试说明盐在泡菜制作中的作用：____________________________。 (3)泡菜风味形成的关键在于__________的加入。 (4)泡菜的制作方法不当，很容易造成泡菜变质，甚至发霉变味，试分析可能的原因：__________________________________________。 (5)发酵过程中应定期测定亚硝酸盐的含量，原因是____________。 (6)测定亚硝酸盐含量的方法是__________。
解析：本题考查对实验流程的理解能力。制作泡菜时选用新鲜蔬菜，有利于降低泡菜中的亚硝酸盐含量。盐、水质量比应控制为1∶4，盐的主要作用是抑制微生物的生长、渗出蔬菜中的水分和调味作用。盐过多会影响泡菜口味，盐过少会滋生杂菌。坛子密封不严或取菜工具不清洁也会使泡菜感染杂菌。发酵的不同时期亚硝酸盐含量会有变化，及时测定可把握取食的最佳时机，而测定亚硝酸盐含量一般采用比色法。
答案：(1)亚硝酸盐含量低 (2)4∶1 加热煮沸的目的是为了杀灭杂菌，冷却后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响 盐有灭菌、渗出蔬菜中过多的水以及调味的作用 (3)调味料 (4)泡菜坛子密封不严，或取菜工具不卫生，或盐的比例过小，都会引起杂菌滋生、泡菜变质 (5)发酵不同时期亚硝酸盐含量会发生变化，及时测定是为了把握取食泡菜的最佳时机 (6)比色法
典例3 如下表所示为某微生物培养基的配方，请回答： 题型三 培养基的配制和应用 典例3 如下表所示为某微生物培养基的配方，请回答： 成分 含量 NaNO3 3 g K2HPO4 1 g KCl 0.5 g MgSO4·7H2O FeSO4 0.01 g (CH2O) 30 g H2O 1 000 mL 青霉素 0.1 万单位
(1)依物理性质划分，该培养基属于__________培养基；依用途划分，则属于__________培养基。 (2)根据培养基原料，所培养微生物的同化作用的类型是__________，培养的微生物可能是__________。 (3)该培养基中的碳源是__________。不论何种培养基，在各成分都溶化后分装前，要进行的是__________和__________，倒平板时，一般需冷却至__________左右，在__________附近操作。 (4)若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去的物质是__________，应加入的物质是__________，为检测纤维素分解菌的存在与否还应加入__________，形成__________色复合物，若产生__________，则证明有纤维素分解菌存在。
解析：考查微生物培养的基本实验。(1)从培养基成分看，没有琼脂等凝固剂，属于液体培养基；从用途上分析，加入青霉素可以杀死细菌、放线菌，选择出霉菌、酵母菌等，属于选择培养基。(2)该生物以培养基中的(CH2O)作碳源，为异养型微生物。(3)考查微生物培养的基本操作。(4)培养纤维素分解菌，是以纤维素作碳源，故应去除(CH2O)；培养细菌应去除能杀灭细菌的青霉素。可用刚果红与纤维素形成红色复合物，检测纤维素分解菌的存在与否。若存在，菌落周围会形成透明圈。 答案：(1)液体 选择 (2)异养型 酵母菌或霉菌 (3)(CH2O) 调整 pH 灭菌 50 ℃ 酒精灯火焰 (4)青霉素和(CH2O) 纤维素粉 刚果红 红 透明圈
技巧点拨：以培养基为核心的命题很常见，我们称作“培养基分析型”试题。这类试题往往涉及以下一些内容：(1)培养基基本成分的分析，应当注意牛肉膏、蛋白胨等成分可提供碳源、氮源及生长因子。(2)培养基用途的分析，结合微生物的营养代谢类型，分析适合培养哪一类微生物。(3)成分增减变化分析，常涉及改变某一种成分，培养基的类型、用途的变化。
题型四 微生物的分离的计数 典例4 下面是探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数的实验，完成下列问题： (1)实验原理：农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。 (2)材料用具：农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。
(3)方法步骤： ①倒平板：分别将无菌培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，操作过程应在火焰旁。 ②制备土壤稀释液：取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至盛有9 mL无菌水的大试管中，依次稀释到107稀释度。 ③涂布：按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布__________个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布1个平板。
④培养：放入恒温箱内，在28～30 ℃下培养3～4 d。 ⑤细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在__________的平板进行计数。如果测定的平均值为50，则每克样品中的菌落数是__________。(稀释度是105)
(4)预测结果：相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落数应多于无氮培养基上的数目。请说明原因____________________。
解析：统计菌落数目的原则是：选出菌落数在30～300的平板进行计数。根据计算方法“每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M”，则有(50÷0 答案：(3)③3 ④30～300 5×107 (4)无氮培养基上能生存繁殖的仅是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存
技巧点拨：微生物分离的常用方法：(1)培养基中的营养成分的改变可达到分离微生物的目的。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物。(2)当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。(3)改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。
随堂演练 1．(2010·北京理综卷)在家庭中用鲜葡萄制作果酒时，正确的操作是( ) A．让发酵装置接受光照 B．给发酵装置适时排气 C．向发酵装置通入空气 D．将发酵装置放在45 ℃ 解析：用鲜葡萄酿造果酒的原理是酵母菌在无氧条件下，分解葡萄糖为酒精和CO2，其最适温度应为18～25 ℃，该过程与光照无关。由于发酵过程中产生CO2，为了防止发酵装置爆裂，应适时排气。 答案：B
2．(2010·江苏卷)如图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，下列叙述正确的是( )
解析：过程①为呼吸作用的第一阶段，发生在细胞质基质中，在有O2和无O2条件下都可进行；过程②在无O2条件下进行。过程③在酵母细胞的线粒体中进行，需要氧气参与；过程④需要氧气参与最后生成醋酸。过程④的最适温度是30～35 ℃，葡萄酒的制作过程的最适温度为18～25 ℃。 答案：C
3．(2010·广东理综卷)(多选)小李尝试制作果酒。他将葡萄汁放入已灭菌的发酵装置中进行实验(见图)，恰当的做法是( ) A．加入适量的酵母菌 B．一直打开阀b通气 C．一直关紧阀a，偶尔打开阀b几秒种 D．把发酵装置放到4 ℃冰箱中进行实验
解析：果酒发酵所需菌种是酵母菌，所以需要加入酵母菌；果酒需酵母菌的无氧呼吸产生，所以阀a要一直关紧；因为在产生酒精的同时还产生CO2，所以要偶尔打开阀b几秒钟。
4．(2010·安徽黄山一模)将配制好的培养基进行灭菌应采用( ) A．灼烧灭菌 B．高压蒸汽灭菌 C．干热灭菌 D．煮沸灭菌 解析：要将配制好的培养基中的所有微生物的细胞、芽孢和孢子杀死，实验室常采用高压蒸汽灭菌法。 答案：B
5．(2010·广东揭阳一模)下列关于微生物分离和培养的有关叙述，错误的是( ) A．微生物培养前，需对培养基进行消毒 B．测定土壤样品中的细胞数目，常用菌落计数法 C．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度 D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源
解析：微生物培养前，需对培养基进行灭菌，而不是消毒；测定土壤样品中的细胞数目，常用菌落计数法而一般不用活菌计数；分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度，以便能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数；分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源。 答案：A
6．(2010·安徽合肥二模)用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时( ) ①可以用相同的培养基 ②都需要使用接种针进行接种 ③都需要在火焰旁进行接种 ④都可以用来计数活菌 A．①② B．③④ C．①③ D．②④
解析：平板划线法或稀释布平板法都使用固体培养基，故①正确；平板划线法采用接种针进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，故②错误；纯化时，要进行无菌操作，需要在火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，故③正确；平板划线法一般用于分离而不是计数，故④错误。 答案：C
7．(2010·北京宣武一模)以下有关生物技术实践的叙述中，不正确的是( ) A．在大肠杆菌的分离和培养实验中，划线后盖好培养皿，须将培养皿倒置培养 B．某同学用带盖的瓶子制备葡萄酒的过程中，每隔12小时左右将瓶盖拧松一次，其目的是向瓶中通气，以保证微生物的发酵 C．将显色后的样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚酸盐的含量 D．可以用稀释涂布平板法来测定某土壤深液活菌数目
解析：酵母菌是兼性厌氧型细菌，无氧时发酵，有氧时繁殖。 答案：B
8．甲、乙两同学合作进行制作果酒和果醋的实验，下面是他们的操作步骤： ①新鲜的葡萄榨汁前先除去枝梗，再将葡萄进行冲洗。 ②把榨汁机、发酵瓶用清水洗干净，晾干后用体积分数为70%的酒精消毒。 ③用榨汁机榨出葡萄汁，然后将葡萄汁煮沸30 min进行消毒，装入发酵瓶，要注意不能超过发酵瓶的2/3。密封充气口，温度控制在30～35 ℃，发酵10～12 d左右，然后用重铬酸钾溶液进行鉴定。 ④当果酒制作好以后，往发酵液中加入醋酸菌，密封。然后将装置的温度控制在18～25 ℃发酵。
(1)以上实验操作有五处错误，请指出并改正。 (2)在进行酒精发酵的过程中，要让酵母菌大量的繁殖，应当如何操作？ (3)在果酒和果醋制作过程中，发酵条件有什么不同？
解析：第(1)小题考查果酒、果醋制作过程中的基本条件和基本操作要求，考查学生对课本基本知识的理解和识记能力。 第(2)小题考查酵母菌大量繁殖需要适宜的条件，在其他条件一定的情况下需通入适量的氧气。 第(3)小题比较酵母菌和醋酸菌的生活条件，属课本的基础知识。
答案：(1)葡萄应该先进行冲洗，再去枝梗；因为我们利用的是葡萄皮外面附着的酵母菌，所以葡萄汁不能加热煮沸；酒精发酵的温度应控制在18～25 ℃；醋酸发酵的温度应控制在30～35 ℃；在醋酸发酵过程中，应不断向发酵液充气。 (2)先往发酵液中通入适量的空气。 (3)温度不同：酒精发酵的温度应控制在18～25 ℃；醋酸发酵的温度应控制在30～35 ℃。对氧气的控制不同：酒精发酵应当先通入空气再隔绝空气；醋酸发酵应当一直通入足够的空气。
9．下面是一则关于腐乳制作方法的传说故事，请你阅读后，讨论下面所提问题。 相传，清康熙八年(公元1669年)，安徽省一进京举子王致和，京考未中，为了生存和准备下一次的考试，便做起了卖豆腐的生意。一天，他发现没卖出的豆腐长了白毛，深感苦恼，但又舍不得丢弃，便将豆腐装入坛内，撒上许多盐腌了，然后密封起来。他继续苦读，到了秋末他才想起此事。打开坛子，一股臭味散发出来，豆腐也变成了青色。他试着尝了一块，没想到“闻着臭，吃着香”。街坊邻居们品尝后也很爱吃。于是，王致和开始专营臭豆腐和酱豆腐的生意。
(1)你能利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事吗？ (2)王致和为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？ (3)你能总结王致和做腐乳的方法吗？与传统方法相比，他缺少了什么环节？ (4)解释“闻着臭，吃着香”的原因。 (5)怎样从空气中获得毛霉等真菌？
解析：腐乳制作原理主要是空气中毛霉孢子落到豆腐上后迅速生长、形成发达的白色菌丝。撒许多盐是为了析出豆腐中的水分，使豆腐变硬，不会过早酥烂，同时抑制微生物的生长，防止腐败变质，增加风味。许多微生物协同作用，将蛋白质分解为肽、氨基酸，将脂肪分解为甘油和脂肪酸；酵母菌进行酒精发酵，酒精与脂肪酸反应生成具有香味的酯类。而细菌发酵产生的硫化物有浓烈臭味。要获得毛霉真菌应用选择培养基进行筛选。在选择培养基中加入抗生素，可抑制细菌等生长繁殖，而对真菌无效，起到筛选的目的。
答案：(1)空气中的毛霉孢子落到豆腐上迅速生长，形成发达的白色菌丝。 (2)析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，不会过早酥烂；同时抑制微生物的生长，防止腐败变质，增加风味。 (3)让豆腐上长出毛霉，将有黏膜的乳块分开后放入坛中，放一层豆腐撒一层盐，最后密封腌制进行发酵；经2～3个月开坛，即成为色味俱全的“臭豆腐”。与传统方法相比，他没有配制卤汤。
(4)经多种微生物的协同作用，将蛋白质分解成小分子肽和氨基酸，将脂肪分解成甘油和脂肪酸，酵母菌进行酒精发酵产生酒精，酒精和脂肪酸生成具芳香气味的酯。而细菌进行发酵产生的含硫化合物具浓烈臭味。 (5)选用加有抗生素的培养基进行筛选。
10．分析材料回答下面的问题： 泡菜制作是以乳酸发酵为主，同时利用食盐的高渗透压作用，兼有将蛋白质分解的微生物发酵过程的冷加工方法，对蔬菜的营养成分、色香味的保存十分有利。 千百年来，泡菜不但以其酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口、回味悠长的特点吸引众多食客，还因其开胃口、促消化、解荤腥、增食欲的功效为世人所乐意接受。
泡菜的制作工艺如下：选料→预处理→配制调料→泡制。 泡菜的制作看上去很简单，但要泡出色香味形俱佳、营养卫生的泡菜，应该掌握原料性质，注意选择容器、制备盐水、搭配调料、装坛等技术。调料是泡菜风味形成的关键，泡菜坛的选择亦关乎泡菜的制作成败。
(1)制作泡菜所利用的乳酸菌，从其结构分析，属于哪类生物？代谢方式是什么？在自然界中的分布如何？ (2)请用反应式表示出乳酸菌发酵的原理。 (3)试举出日常生活中应用乳酸菌的其他实例。 (4)制作泡菜的坛子必须密封，试说明其道理。 (5)为什么泡菜坛内会长一层白膜？你认为白膜是怎么形成的？
解析：泡菜发酵利用的菌种乳酸菌属于原核生物，其代谢类型为异养厌氧型，在自然界中分布广泛。因为乳酸菌能将糖转化为乳酸，生产上人们常用它生产酸奶、制作酸煎饼等。因乳酸菌为厌氧型细菌，所以泡菜坛必须密封，虽然密封，但在发酵初期还是有酵母菌活动，所以在泡菜盐水表面会形成一层白膜。
答案：(1)属于原核生物；异养厌氧型；在自然界中分布广泛，主要分布在空气、土壤、植物体表、人或动物肠道内。(2)C6 H12O62C3H6O3(乳酸) (3)生产酸奶、制作酸煎饼等。 (4)为保证坛内乳酸发酵所需的无氧条件。 (5)形成白膜是由于产膜酵母的繁殖，酵母菌是兼性厌氧型微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖。
11．下表为牛肉膏蛋白胨培养基的成分列表，据此回答： (1)蛋白胨在培养基中的作用是__________。 (2)要用此材料配制观察细菌菌落状况的培养基，还需添加的成分是__________。 (3)表中各成分含量确定的原则是_____________________。 (4)培养基配制好后，分装前应进行的工作是__________。 (5)从配制培养基直到培养完成，所采用的预防杂菌污染的方法是____________________。 (6)在培养基凝固前要搁置斜面，其目的是________________。 成分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl H2O 含量 0.5 g 1 g 100 mL
解析：蛋白胨中含有大量的蛋白质降解而成的多肽类等物质，因而在可提供碳源、氮源和生长因子。微生物菌落的形成是在固体培养基上，所以此培养基还需加琼脂。营养成分含量必须依据所培养微生物的需要而定。配制好后，必须先调 pH，再分装，整个过程要严格无菌操作。
答案：(1)提供碳源、氮源、生长因子 (2)琼脂(凝固剂) (3)依据所培养微生物对各营养成分的需要量 (4)调整 pH (5)高压蒸汽灭菌、灼烧接种环、用酒精擦手、在酒精灯火焰旁接种、用药棉塞紧试管口等 (6)扩大接种面积
12．在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数。 (1)如上图是利用__________法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步__________分散到培养基的表面，为达到这一目的，操作上应注意：__________________________________________(至少答2项)。 (2)分析下面培养基的配方：NaNO3、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、H2O。若此培养基用于培养分解尿素的细菌，则应除去上述__________成分，并加入葡萄糖和__________。
(3)三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下统计结果： 甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236和260，取平均值248； 乙同学涂布了三个平板，统计的菌落是210、240和250，取平均值233； 丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163。 在三位同学的统计中，只有一位同学的统计是正确的，指出另两位同学的统计为什么不正确？__________________________________。
解析：图中显示的微生物接种方法是平板画线法，欲筛选分解尿素的细菌，须以尿素作唯一氮源，即除去 NaNO3换以尿素。 答案：(1)平板画线 稀释 每次画线前要灼烧；冷却后从上一区画线末端开始画；首尾区不重叠 (2)NaNO3 尿素 (3)甲同学只涂布了两个平板，实验数据说服力不够；丙同学其中一个平板的计数结果与另两个相差太远，说明操作过程出现错误，数据缺乏正确性
13．研究分解纤维素的微生物，对于人们在工业生产中的应用有着积极的意义。请回答： (1)分离纤维素分解菌的实验流程： 土壤取样→梯度稀释→将样品接种到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。上述实验中的培养基属于选择培养基，如果设计一个对照实验，可以将其中的纤维素粉换成__________，如果菌落数明显多于选择培养基，即可说明选择培养的作用。 A．尿素 B．蛋白质 C．葡萄糖 D．蔗糖
(2)如何证明选择培养基没有被杂菌污染？ (3)某同学利用植物淀粉酶分解淀粉的实验探究酶的活性，请补充完善酶制备和活性测定的主要步骤：①破碎萌发的水稻种子，提取酶液；②设置对照，滴加酶液；③__________；④纯化处理；⑤测定吸光值；⑥绘制标准曲线。 (4)如果探究温度对纤维素酶活性的影响，自变量是__________，应该保持_____________________________________等(至少答两项)不变。
答案：(1)C (2)选取未接种的培养基与接种样品的培养基，同时培养。如果在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 (3)恒温处理 (4)温度 纤维素酶的量、纤维素酶的浓度、反应时间、pH(答对两个即可)