SARS冠状病毒的细胞分离培养 福建省疾病预防控制中心 沈 晓 娜

一、材料 ♦ Hanks液（每毫升含青、链霉素各2000单位，pH7.0） ♦ 消化液（0.25%胰酶和Versene的混合液） ♦ Eagles培养液（含10%胎牛血清，1%青、链霉素，1%谷氨酰胺，pH7.2） ♦ Eagles维持液A（含2%胎牛血清，1%青、链霉素，1%谷氨酰胺，30mmol/L MgCl2，15% DEAE-葡聚糖，0.05%胰酶，pH7.2）

♦细胞 非洲绿猴肾传代细胞（Vero E6） 人胚肾传代细胞（293） 人肿瘤横纹肌传代细胞（Rda） 人宫颈癌传代细胞（HeLa） 人胚肺二倍体细胞（2BS）

♦标本 尸检组织（肺、脾、肾、肝、心、脑等） 咽拭子 血清

二、实验方法 ㈠ 标本预处理 1.尸检组织（以肺组织为例） 取肺组织标本2g，用pH7.0 Hanks液，洗涤3次，然后研磨成20%悬液，4℃过夜，次日经3000r/min离心15′~20′，取上清。

2.咽拭子 反复搅拌标本管中的棉拭子，并在管壁上多次挤压，将挤得较干的棉拭子弃之，将咽拭液置-80℃冻融一次，2000 r/min离心20′，取上清。 3.血清 取早期病人静脉血，分离血清。 上述标本处理后，即可接种细胞进行病毒分离。若未能及时分离，应置-80℃保存备用。

标本的预处理 肺组织标本2g 咽后壁分泌物 SARA病人的血清 混悬于收集液 （0.9%生理盐水，青、链霉素各2000 U/ml） Hanks液pH 7.0洗涤3次 维持液（30 Mm MgCL2、DEAE—葡聚糖、0.05%胰酶） 研磨制成20%悬液 搅拌后挤出棉拭子上的液体 4℃过夜 -80℃冻融一次 3000 rpm，15~20min 2000 rpm，20 min 接种细胞 上清液接种细胞 上清液接种细胞

㈡ 实验操作 1.细胞消化法传代培养 将上述各类成片的传代细胞瓶中的培养液弃去→加入适量消化液，37℃作用2′~5′→当在显微镜下可见细胞圆缩、细胞间隙增大时，弃去消化液→加入10% Eagles培养液，混匀细胞并记数→以40万/ml细胞浓度接种25cm2培养瓶或10ml培养管→置37℃培养至细胞长成单层。

2.尸检组织病毒分离 弃去已长成单层细胞瓶中的培养液→加入适量20%尸检肺组织悬液，使之完全覆盖细胞表面→置37℃ CO2孵箱吸附1.5h，期间每15′轻摇1次→加入3~5ml维持液→置37℃ CO2孵箱培养，同时设各种细胞的正常对照。 标本接种后，连续7天逐日在显微镜下观察细胞形态变化并记录细胞病变情况：以0%~25%细胞病变为“＋”，26%~50%细胞病变为“＋＋”，51%~75%细胞病变为“＋＋＋”，76%~100%细胞病变为“＋＋＋＋”，细胞形态正常为“－”。当细胞病变至＋＋＋~＋＋＋＋时收获，置-80℃保存待鉴定。

3. 咽拭子标本病毒分离 弃去已长成单层细胞管中的培养液→加入0.2ml咽拭液，34℃吸附4h，期间每15′轻摇1次→加入0.8ml维持液→置34℃转鼓培养（8~12r/h），同时设各种细胞的正常对照。 观察细胞病变同尸检组织病毒分离。

4.血清标本病毒分离 弃去已长成单层细胞管中的培养液→加入0.3ml血清标本和0.2ml维持液→34℃吸附4h，期间每15′轻摇1次→加入0.5ml维持液→置34℃转鼓培养（8~12r/h），同时设各种细胞的正常对照。 观察细胞病变同尸检组织病毒分离。

SARS-CoV in various cell lines RD 293 HeLa

研究发现，标本中的病毒吸附到细胞上后，大约经过16~24h的潜伏期，可产生子代病毒。此时少数细胞变圆，折光度强，胞质中颗粒增多。约在48~72h，从细胞层边缘开始呈现不规则的形态，逐渐出现小聚集，病变细胞圆缩，从容器上脱落。各种细胞出现病变的时间和形态无显著差别。

细胞病变 病毒适宜温度： 35℃~37℃ 吸附时间： 60~90分钟可吸附到细胞上 CPE出现时间： 16~24小时潜伏期后子代产生，表现为少数细胞变圆、折光度好、颗粒增多； 48~72小时达到高峰，细胞形态发生变化，细胞从边缘出现病变，细胞呈现不规则的形态，逐渐出现小聚集，细胞质间颗粒增多，病变不涉及整个细胞单层，病变细胞圆缩，从容器壁脱落 CPE判定： 以0~25%细胞形态变化为“+”，26%~50%细胞形态变化为 “++”，51%~75%细胞形态变化为“ +++”，76%~100%细胞形态变化为“ ++++”,细胞形态正常为“―”。

不同时间病毒感染滴度变化 时间 CCID50/ml 12 20 0.5 32 2.75 53 6.58 60 6.25 70 5.00

5.初步鉴定 目前主要采用以下两种方法，对细胞分离培养物中的SARS冠状病毒进行鉴定。 ♦RT-PCR

病毒分离和鉴定流程 CPE 临床标本 （咽试子、尸检组织、血液） 细胞培养Vero, Vero-E6 (细胞管、细胞瓶) 1—7天 形态学 检测 病毒抗原检测 病毒核酸检测 病毒中和实验 其它实验 EM IFA, WB, ELISA RT-PCR Sequence 蚀斑 终末稀释 血吸附

㈢ 病毒分离应注意的问题 ♦标本采集 一般情况应采集发病早期的标本，并根据患者的临床表现和流行病学特点确定采集标本的种类。 ♦标本采集 一般情况应采集发病早期的标本，并根据患者的临床表现和流行病学特点确定采集标本的种类。 ♦低温转运 采集好的标本，应及时放入冷藏包内，尽快送回实验室。

病毒稳定性观察

♦及时分离 应及时对所采集的标本进行病毒分离。如不能及时分离时，应置-70℃以下低温冰箱和液氮中保存。 ♦盲传三代 如果第一代病毒分离为阴性时，应继续在原细胞培养系统中再传1~2代（即盲目传代）。

THE END Thank you !