第三章 消毒与灭菌 消毒(disinfection) 灭菌(sterilization) 防腐(antisepsis) 无菌法(aseptic method)

消毒：应用物理或化学方法杀灭物体中的病原微生物，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。 灭菌：应用物理或化学方法杀灭物体中所有的病原微生物、非病原微生物及其芽胞、孢子的方法。 消毒只要求达到无传染性的目的，对非病原微生物及其芽胞、孢子并不要求全部杀死。

防腐：应用各种化学药品或物理方法防止或抑制微生物生长繁殖的方法。 无菌法：采取防止或杜绝一切细菌进入动物机体或其他物体的方法。 以无菌法进行的操作称无菌操作。 滤过除菌：指液体或气体通过滤过作用除去其中所存在的细菌。

第一节 物理因素对微生物的影响 影响微生物的物理因素有： 温度、辐射、超声波、滤过、干燥、光线、渗透压等。

一、温度对细菌的影响 按细菌对温度的适应可分为： 嗜冷菌、嗜温菌、嗜热菌 按温度对细菌的影响有： 最适温度、最高温度、最低温度

1. 低温对细菌的影响 大多数微生物对低温具有很强的抵抗力. 环境温度<最低生长温度：代谢活动降低，最后生长繁殖停滞，存活较长时间。 一般细菌菌种在冰箱5-10℃低温下保存。但也有些细菌对低温持别敏感，在冰箱内保存比在室温下保存死亡更快。如禽多杀性巴氏杆菌。

冷冻干燥法：将保存物置玻璃容器内，在冷冻真空干燥器中迅速冷冻，然后抽去容器内的空气，使冷冻物中的水分在真空下直接升华而逐渐干燥，最后在真空下将玻璃容器焊封严密。在这样的冻干状态下，细菌及生物制剂可保存数月至数年而不丧失其活力。 冷冻干燥(冻干)法是保存菌种、疫苗等良好方法。

补充：为什么冷冻保存细菌时，温度必须迅速降低? 若温度缓慢下降，反可促使细菌死亡。这是因为温度逐渐降低可使水分形成结晶，细菌外的水分结晶可使菌体内水分外渗，引起电解质的浓缩与蛋白质变性；菌体内的水分结晶可破坏原生质的胶体状态并机械地损伤胞浆膜的完整性，造成细胞内物质外逸。 若将温度急速降低，则菌体内水分不形成结晶，原生质结成均匀的玻璃样状态。 此外，为减少细菌在冷冻时的死亡，可于菌液内加入10%左右的甘油、蔗糖或牛奶作为保护剂。

补充：反复冻融对微生物活力的影响 反复冰冻与融化对任何微生物都具有很大的破坏力， 因此保存菌种时应尽量避免。

2. 高温对细菌的影响 高温对细菌有明显的致死作用，是最常用的有效的灭菌方法。 其原理多认为热力使菌体蛋白质变性或凝固，酶失去活性，导致细菌死亡。

干热灭菌法(火焰灭菌和热空气灭菌） ①火焰灭菌法 主要用于接种针、接种环、试管口等的灭菌。 ②热空气灭菌法　用加热空气使灭菌物品温度升高到160℃并维持1～2小时以进行灭菌的方法。主要用于干燥的玻璃器皿如试管、吸管、玻璃注射器、培养皿等的灭菌。

干热灭菌注意事项： 1.灭菌结束后，切记不可立即打开箱门，以免着火； 2.灭菌物品不要堆放太紧，以免升温不均匀； 3.灭菌时，要使温度逐渐上升，切忌太快。以免造成玻璃器皿的炸裂； 4.不能耐受160 ℃高温的物品切勿干热灭菌。

湿热灭菌法： 1. 煮沸灭菌 10-20min杀死所有细菌繁殖体；加入1%碳酸钠或2-5%石炭酸，灭菌的效果更好。

2. 巴氏消毒法 用于葡萄酒、啤酒及牛乳等的消毒(不损失营养成分）。 低温维持巴氏消毒法：61-63℃（63-65），30min，然后迅速冷却至10℃左右。 高温瞬时巴氏消毒法： 71-72℃，15s，然后迅速冷却至10℃左右。 超高温巴氏消毒法：使鲜牛奶通过温度不低于132℃的管道1-2s，然后迅速冷却至10℃左右(在常温下的保存期可达半年）。

3.流通蒸汽灭菌法 100℃的蒸汽维持30min (不能杀死芽胞） 4.高压蒸汽灭菌 在一个加有少量水的密闭的金属容器内，通过加热来加大蒸汽压力，以提高温度，达到在短时间内完全灭菌的效果。

①高压蒸汽灭菌时压力与温度的关系 10磅(磅/平方英寸），115 ℃ ， 15磅，121 ℃ ， 20磅，126 ℃ 。

适用于培养基、生理盐水、某些缓冲液、针剂、玻璃器皿、金属器械、工作服等。 血清、血液、酶、氨基酸等，只能采用过滤除菌的方法。 ②高压蒸汽灭菌的适用范围 适用于培养基、生理盐水、某些缓冲液、针剂、玻璃器皿、金属器械、工作服等。 血清、血液、酶、氨基酸等，只能采用过滤除菌的方法。 糖类溶液或含糖的培养基可用10磅15~20min灭菌，若压力、温度过高则可使培养基颜色变深。

③高压蒸汽灭菌时注意事项 排冷空气 灭菌前要检查灭菌器内水位是否正常。 灭菌物品不要互相挤压过紧，以保证蒸汽通畅，使所有物品的温度均匀上升。 不耐热的塑料等材料切勿高压灭菌。

高压蒸汽灭菌锅构造 1、压力表 2、安全阀 3、放气阀 4、软管 5、紧固螺栓 6、灭菌桶 7、筛架 8、水 手提式高压蒸汽灭菌锅

高压蒸汽灭菌锅使用方法 1、加水至止水线； 2、灭菌物品包裹好； 3、开启放气阀； 4、加热排气； 5、达到预定表压，开始计时； 6、关闭热源，当压力降至0.05MPa时，缓慢开启放气阀。

补充：温度敏感诱变育种 高温除了杀菌作用之外，如果使细菌长期处于一定范围的高温条件下，则可诱发变异。例如巴斯德用长期高温条件(42.5～43℃)育成制造炭疽菌苗的菌株，在低温下也有成功的诱变育种报道。

热力灭菌法 焚烧 烧灼 干烤（160~170℃/2h） 干热灭菌法 红外线 巴氏消毒法pasteurization 煮沸法 流动蒸气消毒法 间歇蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法 121℃,15个大气压,20分钟 用较低温度杀灭液体中的病原菌或特定微生物，而仍保持物品中所需的不耐热成分不被破坏的消毒方法。 62℃30‘ 或72℃ 30’‘ 湿热灭菌法 同一温度下,湿热比干热效果好

二、光线对细菌的影响 可见光线的影响 ：肉眼可见的光线对细菌一般无多大影响。但长时间暴露于光线之中，则细菌的代谢与繁殖亦可受到影响。故培养细菌及保存菌种，均应置于阴暗之处。

日光是有效的天然杀菌因素。 如细菌在直射日光下照射半小时到数小时以上即可死亡，芽胞对日光照射的抵抗力比繁殖体大得多，往往需经20小时才能死亡。 阳光暴晒消毒 在实践中，日光对被污染的土壤、牧场、畜舍垫料及用具等的消毒均具有重要意义。

⑴光感作用(Photosensitization) 将某些荧光染料如美蓝、伊红、汞溴红、沙黄等加入培养基中，能增强可见光线的杀菌作用，这种现象称为光感作用。 ⑵光复活作用(Photoreactivation) 细菌受致死量的紫外线照射后，3h以内若再用可见光照射，则部分细菌又能恢复其活力，这种现象称为光复活作用；波长为510nm的可见光对细菌的光复活作用最有效。

日光杀菌作用的原理 日光杀菌作用的主要因素是紫外线，紫外线波长为200～300nm，而以260～265nm杀菌力最强。 实验室使用的紫外灯，其波长通常为253.7nm。 紫外线的穿透力不强，仅限于照射物的表面。

紫外线杀菌原理 紫外线照射细菌时，能使同一股DNA上相邻的两个胸腺嘧啶通过共价键结合成二聚体，以致影响DNA正常碱基的配对，引起致死性突变而死亡。 还有人认为紫外线可使空气中的氧分子转变为臭氧，臭氧再释放出氧化能力强的原子氧而具有杀菌作用。

紫外线杀菌的使用范围 常用于实验室、无菌室、手术室等空气的消毒和近距离物体表面的消毒。 紫外线照射诱变育种 如果细菌吸收的紫外线剂量不足致死量，则引起蛋白或核酸的部分改变，使细胞发生突变。因此，紫外线照射也是一种有效的诱变方法。

三、干燥对细菌的影响 缺水细菌的新陈代谢发生障碍，死亡。 不同种类细菌对干燥的抵抗力差异很大 淋球菌: 干燥的环境中仅能存活几小时 淋球菌: 干燥的环境中仅能存活几小时 巴氏杆菌、鼻疽杆菌、嗜血杆菌: 几天 结核杆菌: 几周至三个月 炭疽杆菌: 几年甚至几十年 由于细菌不能在干燥条件下生长繁殖，因此常用干燥的方法来保存食物、饲料等。

四、渗透压对细菌的影响 盐腌、糖渍——利用高浓度的盐溶液或糖溶液保存食品和其它物品，是由于浓盐或浓糖溶液吸取菌体内的水分，造成细菌的生理干燥导致质壁分离而达到抑菌的目的。

五、其他物理影响因素 电离辐射 红外线 微波 超声波 滤过

第二节 化学因素对微生物的影响 一 消毒剂和防腐剂的概念 消毒剂：用于杀灭病原微生物的化学药物。 防腐剂：用于抑制细菌生长繁殖的化学药物。 化学治疗剂：用于消除宿主体内病原微生物或其他寄生虫的化学药物。

消毒剂与防腐剂之间并没有严格的界限 消毒剂在低浓度时呈现抑菌作用，而防腐剂在高浓度时也能杀菌。 消毒剂与化学治疗剂不同 消毒剂的作用无选择性，能杀死病原体，同时对畜体的组织细胞可能有损害，故只能外用或用于环境的消毒。 化学治疗剂的作用具有选择性 它能阻碍微生物代谢的某些环节，使其生命活动受到抑制或使其死亡，而对宿主细胞毒副作用甚小。

二 消毒剂的种类 （1）使菌体蛋白质变性或凝固，如酚类（高浓度）、醇类、重金属盐类（高浓度）、酸碱类、醛类； （2）损伤胞浆膜，如酚类（低浓度）、表面活性剂、醇类等脂溶剂； （3）干扰细菌的酶系统和代谢，例如某些氧化剂、重金属盐类（低浓度）； （4）改变核酸的功能，如染料、烷化剂。

常用表面消毒剂及应用 类型 名称及使用浓度 作用机制 应用范围 醇类 70-75%乙醇 使膜损伤、蛋白质变性 皮肤、器械 醛类 0.5-10%甲醛 破坏蛋白质氢键或氨基 物品消毒，接种箱、接种室的熏蒸 酚类 3-5%石炭酸 蛋白质变性，损伤细胞膜 地面、家具、器皿 表面活性剂类 0.05-0.1%新洁而灭 蛋白质变性、破坏细胞膜 皮肤、粘膜、手术器械 染料 2-4%龙胆紫 与蛋白质羧基结合 皮肤、伤口 氧化剂类 0.1%高锰酸钾 氧化蛋白质的活性基团 皮肤、尿道 3%双氧水 污染物件表面 重金属类 2%红汞 与蛋白质的巯基结合使失活 0.1-0.5%硫酸铜 植物病原菌 酸碱类 5-10%醋酸 破坏细胞膜和蛋白质 房间消毒

2. 消毒剂的应用 主要用于体表、器械、排泄物和环境的消毒。 选择消毒剂的原则： 杀菌力和穿透力强、奏效快； 易溶于水，使用方便，价格低； 性质稳定，不易分解，便于保存； 对机体或环境无毒性或毒性较小，对消毒物品无腐蚀性，无残留，对环境无污染； 杀菌力不受或少受有机物存在的影响。

三 影响消毒剂作用的因素 ⑴消毒剂的性质 ⑵消毒剂的浓度 ⑶作用时间与其它环境条件 (4)微生物的种类与数量

消毒剂的性质、浓度与作用时间 微生物的种类与数量 温度 酸碱度 有机物 药物的相互拮抗

影响消毒剂作用的因素 细菌 菌龄 种类 消毒剂 种类 浓度 作用时间 环境 有机物 温度 酸碱度

四 抗微生物药物 是指用于消除宿主体内或体表某些微生物并具有选择性毒性的化学药物。其种类很多，广泛用于治疗疾病或预防感染。但也存在毒副作用、耐药性产生、药物残留等问题。

磺胺类药物 — 生长因子类似物 是第一个发现的生长因子类似物药物； 也是人类第一个成功地用于特异性抑制某种微生物的生长来治疗疾病的化学治疗剂。

磺胺类药物的杀菌机制—PABA代谢类似物 (正常代谢物） 磺胺 (代谢物拮抗物）

细菌体内合成叶酸 二氢蝶酸合成酶 二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶 二氢蝶啶 二氢蝶酸 二氢叶酸 四氢叶酸 PABA Glu 辅酶F 核酸合成

细菌体内叶酸合成受阻 磺胺药 TMP 二氢蝶啶 二氢蝶酸 二氢叶酸 四氢叶酸 假二氢叶酸 PABA 辅酶F 核酸合成 二氢蝶酸合成酶 二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶 二氢蝶啶 二氢蝶酸 二氢叶酸 四氢叶酸 假二氢叶酸 PABA 辅酶F 磺胺药 TMP 核酸合成 TMP(三甲基苄二氨嘧啶) ——磺胺增效剂

第三节 生物因素对微生物的影响 一 抗生素（antibiotics） 某些微生物在代谢过程中产生的一类能抑制或杀死另一些微生物的物质。 第三节 生物因素对微生物的影响 一 抗生素（antibiotics） 某些微生物在代谢过程中产生的一类能抑制或杀死另一些微生物的物质。 主要来源于放线菌（如链霉菌），少数来源于某些霉菌（如青霉菌等）和细菌（如多黏菌素），有些亦能用化学方法合成或半合成。

抗菌作用：主要是干扰细菌的代谢过程，抑制其生长繁殖或直接杀灭。 作用机理： 干扰细菌细胞壁的合成； 损伤胞浆膜而影响其通透性； 影响菌体蛋白质的合成； 影响核酸的合成。

主要抗生素和化学治疗剂的作用模型 1.抑制细胞壁合成 2.抑制DNA解旋酶 5.抑制细胞代谢 3.抑制蛋白质合成 细胞膜 3.抑制蛋白质合成 青霉素 万古霉素 杆菌肽 头孢菌素 环丝氨酸 2.抑制DNA解旋酶 诺氟沙星 新生霉素 2. 抑制RNA合成 利福霉素 利福平 TMP 磺胺药 5.抑制细胞代谢 3.抑制蛋白质合成 红霉素 氯霉素 细胞膜 3.抑制蛋白质合成 PAPB 链霉素 卡那霉素 四环素 多粘菌素 短杆菌肽 4. 干扰细胞膜合成

微生物的抗药性 微生物产生抗药性的原因 如何解决微生物的抗药性问题？ 抗药性主要通过遗传途径产生，如基因突变、遗传重组或质粒转移等。 1、产生一种能使药物失去活性的酶； 2、把药物作用的靶位加以修饰； 3、形成“救护途径”； 4、使药物不能透过细胞膜； 5、通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外。 如何解决微生物的抗药性问题？

解决方法 筛选新的抗生素； 对天然抗生素的结构进行改造； 寻找比抗生素疗效更为广泛的生理活性产物； 生物药物素：具有多种生理活性的微生物次生代谢物； 酶抑制剂 免疫调节剂 受体拮抗剂 抗氧化剂

二 植物杀菌素（phytocide） 存在于某些植物中的杀菌物质。 如黄连、黄苓、黄柏、大蒜、金银花、连翘、鱼腥草、穿心莲、马齿苋、板蓝根等都含有杀菌物质，其中有的已制成注射液或其他制剂的药品。

三 细菌素（bacteriocin） 是某种细菌产生的一种具有杀菌作用的蛋白质，只能作用于与它同种不同菌株的细菌以及与它亲缘关系相近的细菌。 细菌素可分为三类： 多肽细菌素，分子量2000～10000u，G+。 蛋白质细菌素，分子量30000-90000u，G-。 颗粒细菌素，由蛋白质亚单位组成，分子量>107 u