第八章 基因工程疫苗 Genetic Engineering Vaccine

疫苗 1976年E. Jenner 从挤奶女工感染的痘疱中获取疱浆，接种接种8岁男孩J.Phipps 的手臂上，结果男孩未感染上天花 1798年医学界正式承认疫苗 1980年世界卫生组织宣布全球消灭天花 疫苗：一切通过注射和粘膜途径接种，可诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原能力的生物制品，包括蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染因子等。

疫苗种类 传统疫苗 灭活苗 弱毒苗 亚单位疫苗 新型疫苗 基因工程亚单位疫苗 基因缺失活疫苗 基因工程活载体疫苗 核酸疫苗

疫苗的基本成分 抗原=疫苗 佐剂：铝制佐剂、油制佐剂 防腐剂：硫柳汞、2-苯氧乙醇、氯仿 稳定剂：乳糖、明胶、山梨醇 灭火剂：物理法：加热、紫外线；化学法：丙酮、酚、甲醛

疫苗的基本特性 安全性：是否致弱？是否反毒？灭活是否彻底？是否污染？ 免疫原性：免疫效果，抗体滴度，持续时间，接种次数 稳定性：生物稳定性，物理稳定性

传统疫苗 灭活苗的研制方法 1、物理灭活 2、化学灭活 乙烯亚胺和双乙烯亚胺：原理与Beta- 丙内酯相同，但未发现致癌作用，被广泛应用。 热灭活：56-57C一小时 紫外线灭活：最大限度保留抗原的完整性和免疫原性 2、化学灭活 福尔马林：浓度、温度、时间和pH Beta-丙内酯：作用核酸，保持免疫原性，水解产物丙酮酸对人体无害，但是有致癌作用，对疫苗产生人员有害。 乙烯亚胺和双乙烯亚胺：原理与Beta- 丙内酯相同，但未发现致癌作用，被广泛应用。

传统疫苗 弱毒苗研制方法 1、自然弱毒：如鸡新城疫LaSota；马立克氏病CV1988 2、异源免疫：Jenner以牛痘病毒预防天花；火鸡疱疹病毒预防马立克氏病。 3、在异源动物或细胞上传代致弱：猪瘟兔化弱毒株是将猪瘟病毒在兔体多次传代致弱而获得的；驴白细胞传代致弱的马传染性贫血疫苗；乳兔肺致弱的猪支原体性肺炎疫苗等。 4、改变体外培养条件：改变温度、加入诱变剂、射线处理，如在加有醋酸铊的培养基中分离的抗醋酸铊的猪副伤寒沙门氏菌和马流产沙门氏菌的弱毒苗。

基因工程疫苗 一、合成多肽疫苗及制剂 合成多肽疫苗（Synthetic Peptide Vaccine）：是用化学方法合成的病源微生物的保护性多肽并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。如丙肝病毒外膜蛋白E2内筛选出一段多肽，可刺激机体产生保护性抗体。 从蛇毒分离出一个13肽（IKAIAALAKKLL），其对革兰氏阴性和阳性菌均有极强的杀菌能力。

二、亚单位疫苗 优点： 安全性好 无热源、变应原、免疫抑制源 与感染产生的免疫应答相区别 研究亚单位疫苗的策略： 确定保护性基因，如鸡传染性支气管炎病毒的S基因；轮状病毒的Vp7和Vp4基因；爱滋病病毒gp120 抗原表达系统： 原核表达系统和真核表达系统

三、基因缺失疫苗（Deletion mutant vaccine ） 定义：将病毒致病基因进行缺失，从而获 得弱毒疫苗 优点：毒力稳定、返祖机率小、免疫力强、 免疫期短。 实例: 伪狂犬病毒TK基因缺失使病毒致弱而 获得。1986年获得美国FDA批准的第一 个基因工程苗。

四、重组活载体疫苗 （一）重组病毒载体 1、重组禽痘病毒(Fowl Poxvirus)载体疫苗: 宿主范围广、滴度高、稳定性好、基因容量大、非必需基因多，已经成功地应用于表达禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和马立克氏病病毒的保护性抗原基因。

2、腺病毒（Adnovirus）载体疫苗：安全、感染非分裂细胞、增殖滴度高、可在消化道和呼吸道繁殖，并能诱导粘膜免疫，可制成口服制剂预防消化道和呼吸 道感染。 3、疱疹病毒（Herpesvirus）载体疫苗：基因组大 （150kb)、容量大、宿主范围窄，故安全、很多疱疹病毒经粘膜感染，诱导粘膜免疫。 已用于载体研究的病毒有：单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒、牛疱疹病毒I型、马疱疹病毒I型、传染性支气管炎等。

（二）重组细菌载体 优点：培养方便、外源基因容量大、刺激 细胞免疫力强，因为细菌本身起到佐剂的 作用。 常用的细菌载体：乳酸菌（Lactic acid bacteria),安全级微 生物，包括乳酸杆菌、乳酸球菌和双歧杆菌。 成功实列：表达破伤风毒素片段C、布氏杆菌L7/L12蛋白。

（三）构建重组载体疫苗的原则 1、载体的选择：载体的安全性，一般来自疫苗株；载体的组织适性应与表达的抗原一致；活载体对外源基因的容量。 2、转移载体的构建：有足够长的同源臂序列（800-1000bp)；有一个适当的启动子。 3、外源基因的插入位点的选择：外源基因的插入不应影响病毒或细菌的复制，即非必需基因。为降低毒力，可将外源基因插入到毒力基因。

核酸疫苗 定义：指将编码某一抗原的外源基因直接导入动物细胞，在宿主细胞中表达并合成抗原蛋白，激发机体一系列类似疫苗接种的免疫应答，起到预防和治疗的目的。 核酸疫苗的特点 1、在体内表达的抗原保持天然构型 2、可构建多价疫苗 3、安全，无整合，无返祖 4、制备简单，降低成本 5、便于运输

核酸疫苗研究现状 1、人类核酸疫苗 1993 Ulmer 将流感病毒NP基因cDNA克隆到真核表达载体，注射小鼠肌肉可诱导特异性IgG和CTL应答； 1993 Wang等人将HIVgp120 基因重组质粒接种小鼠，产生特异性抗体，此抗体可中和HIV对体外培养细胞的感染。 1994 Davis等将乙型肝炎表面抗原克隆到真核表达载体，注射小鼠后，产生特异性抗体。 2、 兽医核酸疫苗 1993 Cox等人将牛单纯疱疹病毒I型（BHV-I）三种不同的和蛋白分别插入pPSVCAT表达载体中，注射天然宿主动物后产生特异性中和抗体， 对强度攻击有保护效果。 此外对禽流感疫苗、伪狂犬病疫苗、猪流感疫苗、牛病毒性腹泻疫苗、新城疫疫苗等得到广泛应用。

核酸疫苗研发的一些问题 1、核酸疫苗的结构：⑴载体：启动子、增强子和3端多聚A信号；⑵编码抗原的基因 2、接种方式：肌肉、皮下、腹腔和静脉，基因枪接种效果最好。 3、核酸疫苗免疫效果的影响因素：⑴ 启动子 ⑵ DNA输入组织的方式 ⑶ 佐剂，可考虑加入细胞因子如IL-2等 4、核酸疫苗的安全性：DNA 整合引起内源性癌基因插入激活的可能性；产生抗DNA抗体 的可能性。

T细胞疫苗 1、治疗自身免疫病的T细胞疫苗 二种致病T细胞：引起自身免疫性疾病的T细胞和导致同种移植排斥的T细胞。将这些T细胞活化灭活作为疫苗，可诱导机体产生针对致病性T细胞的免疫应答，从而减轻T细胞的致病作用。T细胞疫苗用于治疗小鼠变态反应性脑脊髓炎已获成功。T细胞疫苗治疗人多发性硬化症有一定效果。 2、治疗病毒性疾病的T细胞疫苗 用多肽在体外诱导产生特异性的CTL，经克隆、扩增、筛选和鉴定后，将MHC-I型CD8T细胞导入机体，诱导细胞产生免疫应答。

树突状细胞疫苗（Dendritic Cell Vaccine） 树突状细胞：是专职抗原递呈细胞（APC），能有效的将抗原递呈给T细胞，从而诱导CTL活化，是诱发CTL抗肿瘤免疫反应的核心步骤。荷载抗原的DC具有疫苗的功能，故称为树突状细胞疫苗。荷载抗原既可以是病毒抗原，也可以是肿瘤细胞成分。 1、肿瘤抗原和肿瘤细胞致敏的DC疫苗 2、提纯和重组的肿瘤抗原多肽或蛋白致敏的DC疫苗 3、编码肿瘤相关抗原和细胞因子转染的DC疫苗 4、其它类型的DC疫苗-肿瘤抗原特异性抗体致敏的DC疫苗

肿瘤疫苗 第一代肿瘤疫苗：整个肿瘤组织或肿瘤细胞的提取液加入非特异性佐剂制成。 第二代肿瘤疫苗：基因修饰的肿瘤细胞或重组的肿瘤抗原。 肿瘤疫苗分为三类： 1、增加肿瘤抗原免疫原性的疫苗 2、基因修饰的肿瘤疫苗 3、以树突细胞为基础的肿瘤疫苗

免疫佐剂（Immunoadjuvant） 定义：佐剂是先于抗原或与抗原同时使用，能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答。能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质，又称免疫佐剂。 佐剂的作用特点： 1、可选择性地改变免疫应答类型：MHCI或MHCII型、抗体种类和辅助T细胞类型。 2、改变抗原类型，从而诱导T辅助细胞或细胞毒T淋巴细胞。 3、可延缓疫苗在注射部位的消失。

佐剂的种类 1、矿物质：常用的有氢氧化铝和磷酸铝， 铝制剂主要诱导体液免疫，是人医和兽医都获批准的佐剂。 缺点是易形成肉芽肿和无菌脓肿。 2、油乳佐剂：主要有弗氏佐剂（Freund‘s Adjuvant，1935），即乳化的水油佐剂，分为完全弗氏佐剂和不完却年弗氏佐剂。 弗氏不完全佐剂（FIA）：由低黏度矿物油和乳化 剂组成。作用与铝盐类相似，延缓抗原的吸收， 但诱发细胞免疫较差。 弗氏完全佐剂：即在FIA中加入分枝杆菌，可增强抗体效价，增强细胞免疫，可能有致癌作用，故仅限于兽医。

其它乳化佐剂剂 佐剂-65：可在机体代谢后排泄，不引起局部反应，激发的抗体滴度比FCA高数十倍，有希望成为矿物油的代替品。 白油-Span佐剂：Span-80、Span-85 及Tween-80作为乳化剂是兽医生物制品最有效的佐剂之一。 MF-59：一种鲨烯水包油乳剂，已经证明可以增加流感病毒疫苗的免疫原性，对新生儿也是安全的。 SAF：由苏氨酰胞壁酰二肽、Tween-80、非离子嵌段表面活性剂、角沙醇等组成。机制是抗原包被在油相形成的微结构内，形成储存库而缓慢释放，增强体液和细胞二种免疫途径。 新型乳化剂Montanide888：一种二缩甘露醇油酸盐，黏滞度低，可滤过出菌，抗体产生早，水平高，但持续时间较短。有望成为人用疫苗佐剂。

3、微生物佐剂 短小杆菌：加热或甲醛灭活能非特异性刺激淋巴细胞样组织增生，加强单核巨噬细胞的吞噬能力，增加IgG和IgM的生成。 卡介苗：巨噬细胞的激活剂，同时还能刺激骨髓多能干细胞分化免疫活性细胞，是一种非特异性的免疫增强剂。 细菌脂多糖（LPS）：LPS可促进B细胞的有丝分裂，促进巨噬细胞分泌细胞因子，如IL-1可调节巨噬细胞表面Ia分子的表达，从而改善抗原的提呈。

4、脂质体和Novasomes 脂质体是人工合成的双分子层的磷脂单层或多层微环体，促进抗原提呈的定向作用，已证明小于5μm 的脂质体微粒能被肠道淋巴细胞结吸收并传递给MФ 。脂质体无毒、无免疫原性。实验结果表明新城疫病毒外膜蛋白-脂质体疫苗明显优于单独外膜蛋白疫苗；Novasomes是一种非磷脂的亲水脂分子，比脂质体稳定，廉价，用于粘膜免疫。

5、中草药类 蜂胶：是一种天然的免疫增强剂。据报道，蜂胶或与抗原同时使用增强免疫功能，增强补体和吞噬细胞的活力，增加白细胞的数量和抗体的滴度，并明显增加凝集素的产生。 皂甙及皂甙提取物Qs21：皂甙是皂甙树的粗提物不能用作佐剂，从皂甙提取的成分Qs21可用作疫苗的佐剂。Qs21作为呼吸道合胞体病毒融合蛋白的佐剂与铝佐剂相比，抗原特异性抗体增加了90倍，细胞毒淋巴细胞的杀伤作用也明显增强。 多糖、糖苷及复方中药：中药多糖可激活T、B、巨噬细胞、NK、CTL、LAK细胞、补体，促进细胞因子的生产，有望开发成为新型疫苗佐剂。用当归多糖作为乙型肝炎基因工程疫苗的佐剂可明显提高抗体水平，明显优于铝佐剂。还有用猪苓多糖和香菇多糖与乙肝疫苗联合使用的报道，收到良好的效果。一些复方中药作为佐剂，如紫术散、当归补血汤等对激活免疫系统有很大作用。中药佐剂安全、有效、可靠、稳定是很有发展前景的佐剂。

6、细胞因子 细胞因子可调节抗体应答与细胞介导免疫应答的相互关系，因此，可直接作为免疫佐剂发挥作用。实验证明细胞因子IL-1、IL-2、IFN-gamma等均可作为佐剂。但是，由于所有细胞因子均表现剂量依赖性毒性，而且作为蛋白质半衰期短、生产成本高，限制了其在临床应用。 7、药物类佐剂 左旋咪唑：广谱驱虫药。可提高T、巨噬细胞和适中性白细胞的活性，诱导T细胞的分化成熟。与NDV疫苗联用明显提高抗体水平。此外，一些抗菌素、硒和维生素E均有佐剂的作用。

思考题 1、传统疫苗的种类 3、新型疫苗的种类 4、疫苗的基本成分 5、疫苗的基本特征 6、灭活苗的研制方法 7、传统弱毒疫苗的研制方法 8、举例说明研制基因缺失疫苗的方法 9、构建重组载体疫苗的原则 10什么是核酸疫苗？ 11、佐剂的种类