X-射线晶体学

X-射线晶体学 概况 几何晶体学与X射线晶体学基本知识 单晶培养 衍射数据收集 结构测定中的几个问题 应用实例

概况 方法特点 分辨率：原子或亚原子分辨率 对分子大小没有限制 要求得到样品的单晶（三维晶体） 测定晶态的分子结构 相位问题 目前分辨率超过1Å的结构有130个（2002年）（最高达0.54Å） H原子位置大多难于确定 对分子大小没有限制 要求得到样品的单晶（三维晶体） 测定晶态的分子结构 相位问题 方法和技术手段成熟，向全自动化方向发展

概况 为什么用X-射线？ 光波与可测量物体的大小

概况 X射线晶体结构分析的原理和过程

概况 晶体结构测定的步骤 单晶培养 衍射数据收集 相位的确定 电子密度图的计算和解释 结构模型的修正

概况 其它衍射方法 纤维衍射 小角度X射线散射 中子衍射 如DNA双螺旋结构的发现 研究生物大分子在溶液中的结构信息 分辨率低 单晶中子衍射：H原子位置测定 小角度中子散射：研究溶液中生物大分子复合物的结构 缺点： 需要配合核反应堆使用 中子辐射强度小，需要单晶体积大，数据收集时间长

几何晶体学与X射线晶体学的基本知识 概念： 几何晶体学是研究晶体的外部形态与内部结构的规律的科学 1669年，丹麦学者Nicolaus Steno发现了晶面角守恒定律 到19世纪末，几何晶体学理论基本成熟 X射线晶体学是利用X射线衍射现象来研究晶体结构的科学 1912年，Max von Laue发现晶体的X射线衍射现象 到20世纪中期，X射线晶体学的理论基本成熟

几何晶体学与X射线晶体学基本知识 晶体的点阵结构 对称性、晶系、空间群 晶体的X射线衍射与衍射方向 衍射线的强度 电子密度函数

晶体的点阵结构 什么是晶体？ 点阵 晶胞 单晶、孪晶、多晶、微晶

什么是晶体？ 晶体的外形特征

什么是晶体？ 晶体的内部结构 铂表面的扫描隧道显微象，示意铂原子的周期排列

什么是晶体？ 晶体是由原子（或离子、分子）在空间周期性的排列构成的固体物质，它具有三维空间结构的周期性。 重复周期的大小和数量 小分子晶体：周期为 ~1 nm，对边长1 mm的晶体，周期数可达106 大分子晶体：周期为~10 nm，对边长1 mm的晶体，周期数可达105 估算一颗每边长0.5 mm的蛋白质晶体中含有多少个蛋白质分子 地球上大部分固体物质都是晶体结构

点阵 NaCl的晶体结构与点阵

点阵 将晶体结构中周期重复的那部分结构抽象成一个几何点来代表，这些点在三维空间中按一定的周期重复排列构成点阵，每个点阵点代表的具体内容称为晶体的结构单元。 点阵的性质 每个点阵点都具有相同的周围环境 点阵按照连接其中任意两点的向量平移后都能复原，称为点阵的平移对称性

点阵 直线点阵和平面点阵

晶胞 晶胞是按照晶体结构的周期性划分的平行六面体，是晶体结构的基本重复单位 晶胞的规定：晶轴、晶胞参数 晶胞参数： a, b, c, a, b, g

晶胞 晶胞的划分原则 按照特征对称元素划分晶胞 要求划分的晶胞对称性最高， 体积最小

单晶、孪晶、多晶、微晶 单晶：整块晶体基本上为一个空间点阵所贯穿 孪晶：两个或两个以上的同种单晶按一定的对称关系相互结合在一起的晶体 多晶：由许多取向不同、随机排布的小的单晶聚集而成的晶体 微晶：颗粒很小（um数量级），结构的周期性范围很小，只有几十个周期，称为微晶

几何晶体学与X射线晶体学基本知识 晶体的点阵结构 对称性、晶系、空间群 晶体的X射线衍射与衍射方向 衍射线的强度 电子密度函数

对称性、晶系、空间群 对称性、对称操作、对称元素 对称元素的种类 晶系 空间群

对称性、对称操作、对称元素

对称性、对称操作、对称元素 由两个或两个以上的等同部分组成的物体，通过一定的操作后，等同部分相互调换位置，整个物体恢复原状而又不改变任何内部两点间的距离，这种性质称为对称性 使对称物体的等同部分相互调换位置，整个物体恢复原状的操作，称对称操作 对称操作所依据的点、线、面等几何元素，称为对称元素

对称元素的种类 宏观对称元素 微观对称元素 ——————————————————————————— 旋转轴（n） 镜面（m） 对称中心（i） 旋转反轴（ ） 微观对称元素 平移 滑移面 螺旋轴（ns） ——————————————————————————— ：第一类对称元素，不产生对映体 ：第二类对称元素，产生对映体

晶系 晶体按照宏观对称性可划分成7种类型，称为7个晶系，每个晶系有自己特征的对称元素 与7个晶系相对应，有7种晶胞类型，每种晶胞对晶胞参数有相应的规定

空间群 晶体的点阵结构与各种对称元素相互组合，形成各种不同的组合形式

几何晶体学与X射线晶体学基本知识 晶体的点阵结构 对称性、晶系、空间群 晶体的X射线衍射与衍射方向 衍射线的强度 电子密度函数

晶体的X射线衍射与衍射方向 衍射现象

晶体的X射线衍射与衍射方向 一个原子对X射线的散射

晶体的X射线衍射与衍射方向 晶体的X射线衍射

晶体的X射线衍射与衍射方向 衍射线的方向 劳埃方程 a ( cosa － cosa0 ) = hl b ( cosb － cosb0 ) = kl c ( cosg － cos g0 ）= ll 布拉格方程 2 d(hkl) sinq(hkl) = l 衍射方向只与晶胞的形状和大小有关

衍射线的强度 一个原子的散射 原子散射因子 f

衍射线的强度 一个晶胞的散射强度 晶体的衍射强度正比于结构振幅的平方，即 Ihkl  |Fhkl|2 结构因子 Fhkl=∑j fj exp[ i 2p (hxj+kyj+lzj) ] = |Fhkl| exp[iahkl] 晶体的衍射强度正比于结构振幅的平方，即 Ihkl  |Fhkl|2 衍射强度与晶胞中原子的数量、种类和空间分布有关

电子密度函数 电子密度函数的计算公式 结构因子和电子密度函数的相互变换关系—傅里叶变换

第二节 X-射线晶体学 概况 几何晶体学与X射线晶体学基本知识 单晶培养 衍射数据收集 结构测定中的几个问题 应用实例

单晶培养（晶体生长，Crystallization） 生物大分子单晶培养印象 它是一门过多依赖于经验的手艺 它是晶体学中最不确定、最耗时的步骤 它已经成为大分子晶体结构测定的限速步骤

单晶培养（晶体生长，Crystallization） 结晶原理 影响生物大分子结晶的因素 晶体培养方法 晶体的鉴别与储存

结晶原理 晶体生长的过程： 溶液达到过饱和度⇒晶核形成⇒晶核长大⇒晶体 晶核形成的方式 单晶培养的要求 均相成核 异相成核 晶核数要少 晶体生长的过程： 溶液达到过饱和度⇒晶核形成⇒晶核长大⇒晶体 晶核形成的方式 均相成核 异相成核 单晶培养的要求 晶核数要少 晶体生长的速度要慢 ——— 控制过饱和度

结晶原理 蛋白质的溶解度曲线与晶体生长

影响生物大分子结晶的因素 样品的纯度与微观均一性 pH值 沉淀剂 盐类 有机溶剂 温度 浓度：5-30mg/ml 金属离子 震动

影响生物大分子结晶的因素 添加剂：甲醇、乙醇、甘油、DMSO 增溶作用 冷冻保护作用 溶液中的微粒和气泡 器皿的清洁度 重力条件

晶体培养方法 汽相扩散法 悬滴法 坐滴法 液相扩散法 透析法 界面扩散法 液桥法 分批静置法 溶剂蒸发法 诱导结晶法 接种法

晶体培养方法 汽相扩散法 悬滴法 坐滴法

晶体培养方法 汽相扩散法 悬滴法

晶体培养方法 液相扩散法 透析法 界面扩散法 液桥法

晶体培养方法 分批静置法

晶体培养方法 溶剂蒸发法 诱导结晶法 接种法

晶体生长方法的发展趋势 微量化：ml → ul → nl 自动化：机器人

晶体的鉴别与储存 晶体的鉴别 晶体的储存 衍射实验 观察晶体外形 晶体硬度和脱水情况 偏光性能：小分子强于大分子 染料染色：甲基蓝，考马斯亮蓝 晶体密度 晶体的储存 母液保存 超速冷冻保存

第二节 X-射线晶体学 概况 几何晶体学与X射线晶体学基本知识 单晶培养 衍射数据收集 结构测定中的几个问题 应用实例

衍射数据收集

衍射数据收集 晶体的安装和处理 X射线源 X射线衍射仪 数据解析

晶体的安装和处理 数据收集要求的晶体大小 晶体的选择：普通显微镜下观察 晶体的安装和处理 旋转阳极：0.1~0.5 mm 光滑的表面，尖锐的棱角，无内含物，无裂纹，无断层 晶体的安装和处理 毛细管密封法 低温冷冻法

晶体的安装和处理 毛细管密封法

晶体的安装和处理 低温冷冻法

X射线源 阳极靶式 光强 辐射功率 同步加速器 100~10,000 上百千瓦 对X射线源的要求： 封闭管 1 旋转阳极管 4~12 几十瓦 阳极靶式 光强 辐射功率 封闭管 1 旋转阳极管 4~12 几十瓦 同步加速器 100~10,000 上百千瓦 对X射线源的要求： 光强尽可能大 光强越大，晶体的衍射强度越大，数据误差越小

旋转阳极管

同步加速器 磁场 同步辐射 e v

同步辐射的优点 亮度高 发散度小 波长连续可调 可获得较短波长的X射线

X射线源的附属装置 滤色片或单色器 准直器

衍射数据收集 晶体的安装和处理 X射线源 X射线衍射仪 数据解析

X射线衍射仪 X射线源 校准系统 X射线记录系统 计算机控制处理系统

X射线衍射仪

X射线衍射仪

X射线记录系统－Mar

X射线记录系统－Multiwire

X射线衍射仪 收集一套完整的衍射数据的时间 早期（1950）：几个月 阳极靶式：几天 ~ 一周 第三代同步辐射：几秒 ~ 几分钟

衍射数据收集 晶体的安装和处理 X射线源 X射线衍射仪 数据解析

数据解析 数据的质量 数据的质量与晶体的好坏、X射线源的强度以及收集数据的仪器和方法有关 数据的分辨率： 数据的完整度： 布拉格方程：d = l/2sinq  l/2 布拉格角q越大，分辨率越高 数据的完整度： 理论衍射点数与分辨率倒数的三次方成正比 完整度 = 实际衍射点数/理论衍射点数 一般要求：> 80 %

数据解析

数据解析 数据的统一和还原 结构解析 数据的校正 衍射线的强度（I）与振幅（F）： 多套数据的统一 相位的确定 电子密度图的计算和解释 结构精修

第二节 X-射线晶体学 概况 几何晶体学与X射线晶体学基本知识 单晶培养 衍射数据收集 结构测定中的几个问题 应用实例

结构测定中的几个问题 相位的确定 电子密度图的计算和解释 结构精修 结构模型的表达

相位的确定 同晶置换法（MIR） 多波长反常散射法（MAD） 分子置换法（MR） 同晶差值傅里叶法

同晶置换法（MIR） 原理：在生物大分子晶体中的固定位置引入原子序数高的重原子后其衍射强度会发生变化，通过比较一个纯净晶体和多个包含重原子的晶体的X射 线衍射模式，可以测定晶体中重原子的位置，这些重原子起到标志的作用，可以推出衍射点的相位。 方法特点 适用于全新的蛋白质结构测定 要求制备多个同晶重原子衍生物 计算较复杂 重原子衍生物：通过某种方式在晶体中引入原子序数远大于碳、氮、氧的重原子而构成的晶体。 制备方法：浸泡法，化学修饰法，共晶法，硒代蛋氨酸法 同晶性：引入重原子后晶胞参数的变化小于1%，衍射强度的平均变化不随分辨率的增加而升高。

多波长反常散射法（MAD） 原理：利用原子的反常散射效应随X射线波长而改变的特点，采用多个波长测量晶体的衍射数据，从而使一个重原子衍生物相当于多个重原子衍生物而被用于确定相位 方法特点 适用于全新蛋白质结构测定 要求一个重原子衍生物 要求波长可调的同步辐射X射线源 对数据收集的测量精度要求较高

分子置换法（MR） 原理：使用一个已知的类似物的三维结构作为初始模型，经过旋转和平移的计算，将模型分子放到待测晶胞中置换未知目标分子，然后根据这个初始模型计算各衍射点的相位。 方法特点 适用于同源或类似蛋白质的结构测定 只需要一套衍射数据，不需制备重原子衍生物 结构类似程度越高，相位越准确 计算较简单

同晶差值傅里叶法 原理：如果待测结构与已知结构的差异很小并且是同晶型的，可以直接采用已知的结构计算相位 方法特点 适用于与已知结构同晶的物质的结构测定 计算很简单

结构测定中的几个问题 相位的确定 电子密度图的计算和解释 结构精修 结构模型的表达

电子密度图的计算和解释 电子密度图的计算和显示 电子密度函数的计算 电子密度图的显示 为了突出原子的形状及整个结构，可以在平面或空间中把电子密度相同的点用线连接起来，绘成等高线图，称为电子密度图。

电子密度图的显示

电子密度图的计算和解释 分辨率与电子密度图 低分辨率的电子密度图（d > 4.5Å） 可以确定分子边界和分子大小，看到a螺旋的棒状电子密度 中等分辨率的电子密度图 （2.5Å < d < 3.5Å） 可以跟踪蛋白质分子肽链的走向和辨别部分侧链，根据一级结构信息，可以建立分子模型 高分辨率的电子密度图 （d < 2Å） 可以辨别不同侧链的密度，建立正确的分子模型，定位晶体中的有序水分子

分辨率与电子密度图

电子密度图的计算和解释 电子密度图的解释 要求： 至少中等分辨率的电子密度图 蛋白质的氨基酸序列 方法： 计算机图像仪和分子建模程序

电子密度图的解释

结构精修 早期的实空间修正法：使模型的计算电子密度与观察的电子密度得到最好的拟合。 倒易空间的最小二乘修正方法 结构修正的循环过程： 原理： 使模型的计算结构振幅与观察的结构振幅得到最好的拟合。 表征修正模型质量的指标：R因子 结构修正的循环过程： 初始结 构模型 新的 模型 最终 模型 程序 修正 计算电子密度 图并手工调整

结构模型的表达 结构数据文件 PDB格式 mmCIF格式 ASN.1格式 结构模型的表达 实体模型 计算机绘制的模型图

结构模型的表达 实体模型

结构模型的表达 计算机绘制的模型图 线框模型 卡通模型 空间填充模型 表面模型

结构模型的表达 计算机绘制的模型图 立体对图

应用实例：细菌核糖体的晶体结构测定 核糖体的组成 核糖体的晶体结构研究 核糖体的晶体结构模型

28S rRNA + 5.8S rRNA + 5S rRNA + ~50个蛋白质 核糖体的组成 原核生物 真核生物 沉降系数 70S (50S + 30S) 80S (60S + 40S) 分子量 2.5  106 2.9  106 大亚基 23S rRNA + 5S rRNA + 30~40个蛋白质 28S rRNA + 5.8S rRNA + 5S rRNA + ~50个蛋白质 小亚基 16S rRNA + ~20个蛋白质 18S rRNA + ~33个蛋白质

核糖体的晶体结构研究 1980年，以色列的Yonath报道了核糖体50S亚基的第一颗晶体 1985年，Yonath获得了Haloarcula marismortui核糖体大亚基的晶体 1987年，Trakhanov和Yonath相继报道了Thermus thermophilus核糖体70S颗粒和30S亚基的晶体生长 1998年，发表了H. marismortui核糖体50S亚基的9 Å分辨率电子密度图 1999年，相继发表了核糖体两个亚基的大约5 Å分辨率的电子密度图和完整颗粒的7.8 Å分辨率的电子密度图 2000年， H. marismortui核糖体50S亚基的结构解析到了2.4Å分辨率；Thermus thermophilus核糖体30S亚基的结构解析到了3 Å分辨率

核糖体的晶体结构研究

核糖体的晶体结构模型 70S 完整颗粒，From Jamie H.C. et al. (1999). Science. 285:2095-2104. 分辨率：7.8 Å

核糖体的晶体结构模型 30S亚基，from Wimberly BT et al. (2000). Nature. V407. 分辨率：3.0 Å 50S亚基，from Ban N et al. (2000). Science v289. 分辨率：2.4 Å