细胞悬浮培养和突变体筛选 细胞悬浮培养的方法和特点 突变的概念及突变体的用途 体细胞无性系变异与细胞突变体筛选

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖，或者是诱导形态形成（例如胚胎发生）的无菌培养技术。 相对于采用固体培养基的培养，液体悬浮培养体系在取得状态比较一致的细胞群体，进行突变个体的筛选、以及进行大规模的培养以生产有重要价值的次生物质（药用物质）方面有重要的应用。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 1，细胞悬浮培养的方法 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 1，细胞悬浮培养的方法 1.1，摇床和三角瓶 一般细胞增殖、营养生理等研究、细胞分裂同步化、细胞再分化（胚胎发生）的研究、原生质体供体材料的准备等。 1.2，转轮和试管液体培养 与1.1相似但较少用 1.3，悬滴培养 单细胞或少量的原生质体或原生质体融合后的杂种细胞等； 1.4，发酵罐培养 用于进行次生代谢物质生产的悬浮培养；

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 1，细胞悬浮培养的方法 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 1，细胞悬浮培养的方法 摇床有两种摇荡的形式，一种是往复式的（来回移动，运动面上的每一个点的轨迹都是一条直线），另一种是涡旋式的（不是旋转，运动面上的每一个点的轨迹都是一个直径相同的圆圈）。 衡量摇床工作状态的两个参数是每分钟的摇荡频率和摇荡的位移距离。此外，运转是否平稳和承载重量是购买时需要考虑的指标。

试管 转 轮 试 管 液 体 培 养 装 置 中心轴 （角度可调） 传动轴 （速度可调） 示意图

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 1，细胞悬浮培养的方法 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 1，细胞悬浮培养的方法 摇床的作用是使细胞组织在培养基中成为悬浮状态，促进液体培养基（液相）和空气的混合，提高培养基中氧气的含量，使组织细胞不会沉积在培养容器的底部造成缺氧。 因此， 如果是不会被液体淹没的大块组织，可以考虑采用浅层液体培养基静止，这时不需要摇床。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 2，细胞悬浮培养的培养基 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 2，细胞悬浮培养的培养基 一般来说，能够让某种植物细胞组织正常生长增殖的固体培养基去掉固化剂后都可以用来进行该种植物的液体悬浮培养。 对培养基进行适当的改造能够改善培养效果。方法主要有如下几种：

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 2，细胞悬浮培养的培养基 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 2，细胞悬浮培养的培养基 提高2,4-D的浓度和降低分裂素的浓度能够提高悬浮细胞的分散程度； 悬浮培养的细胞对维生素和氨基酸的有比较明显的更大量的需求； 无机磷酸盐的消耗比较快，加大无机磷酸盐的浓度（3-5倍）可以维持细胞系较长时间的稳定增殖； B5和ER（Eriksson，1965）是两种典型的液体培养基。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 3，细胞悬浮培养的特点 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 3，细胞悬浮培养的特点 3.1 不用使用琼脂等培养基固化剂，不仅减少成本而且能使培养结果不受固化剂中杂质的影响。 3.2 便于更换培养基的操作，借此可以减少人工劳力。 3.3 在液体培养条件下植物组织失去了生长的方向性。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 3，细胞悬浮培养的特点 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 3，细胞悬浮培养的特点 3.4 液体培养容易发生污染并且污染难以被发现。 3.5 愈伤组织在液体培养条件下易于分散，细胞总体活性较强，增殖率较高，细胞分裂周期的同步性较好。 3.6 培养基不会出现由于植物组织吸收而造成营养浓度梯度，植物组织的分泌物也不会在植物组织的近旁积累，因此在多数情况下对组织细胞增殖有利。 3.7 在培养过程中细胞的生长和增殖呈现典型的“S”型曲线。

生长曲线

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 细胞计数 细胞密实体积 细胞重量

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 4.1 细胞计数 虽然悬浮培养细胞比较分散，但远没有达到单细胞分散的水平，因此，需要采用方法使细胞团分散成为单细胞才能够进行细胞计数。 使细胞团分散的方法有两种，即铬酸法和果胶酶法。分散后，在显微镜下计数。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 例，铬酸法的实验方法 取1份培养细胞（用滤纸吸除表面水分）加入2份容积的8%的三氧铬酸溶液中，在70 C加热5-15分钟；冷却后用力振动10分钟分散细胞团成为单细胞，然后用血球计数板在显微镜下计数。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 4.2，细胞密实体积（packed cell volume, PCV） PCV除了以上含义外，常常用于表示每毫升含有细胞的培养液中的细胞的体积，这时的单位是每毫升培养液的PCV毫升（立方厘米）数。 这种情况下的测量方法是将悬浮培养液注入刻度离心管，在2000g（？）的条件下离心5分钟，然后根据刻度读取数值。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 4，悬浮培养细胞生长的计量 4.3，细胞鲜重和干重 用滤纸等抽滤除去液体培养基后称重得到鲜重； 用滤纸等抽滤除去液体培养基后，在60－80 C条件下烘至恒重（约12小时）。干重一般以每毫升PCV的重量表示。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 根据细胞悬浮培养的特点，有两个方面的重要应用。 5.1，细胞分裂周期同步化 5.2，细胞无性系突变筛选

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 5.1，悬浮培养细胞的同步化 同步培养是指在培养中大多数的细胞都处在细胞周期的相同阶段。同步程度以同步百分数来表示。 对于一个植物体，或是一块愈伤组织，其中的细胞处在各种状态，细胞周期的同步化是很低的。 液体培养中，可以采用某些方法，使培养组织分散成微小的细胞团；再通过一些方法，实现整个培养系内的所有细胞团的多数细胞的分裂同步化。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 5.1，悬浮培养细胞的同步化 培养细胞的同步化为科学理论研究，例如细胞的分裂和代谢等方面，提供了一个优越的研究材料体系；在应用方面，例如人工种子的生产上，也可能有实用价值。 实现培养细胞同步分裂的方式有物理性质和化学性质两种调控方式。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 5.1，悬浮培养细胞的同步化 物理方式包括对培养细胞的物理环境（光照和温度等）进行控制，主要方法是低温休克法。 因为细胞处在分裂的不同时期对低温的敏感程度不同，采用合适的温度可以使细胞分裂能够进行到某一阶段而不再继续进行。 当条件恢复正常后，这些细胞从相同的阶段同时开始相同的分裂活动内容。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 5.1，悬浮培养细胞的同步化 化学的方式有饥饿法和抑制法两种方法。 饥饿法是对细胞断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，然后，重新在培养基中加入这种限制因子，这些静止的细胞就会同时进入细胞分裂的相同阶段。 抑制法是加入一些抑制性的物质使细胞分裂停止进行，然后除去这些物质使细胞同时重新开始分裂。

第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 第一节 细胞悬浮培养的方法和特点 5，悬浮培养体系的应用 5.2，细胞无性系突变筛选 涉及到细胞工程的另一个重要内容，合并到下一节中进行讲解。

第二节 无性系变异及突变体的用途 1，无性系变异 1.1，基本概念 无性系变异指细胞在离体培养过程中所产生的可以遗传的变异。1981年由澳大利亚的Larkin和 Scowcroft提议，通称为体细胞无性系变异（Somaclonal variation，SV）。 由性细胞培养产生的变异，实际上仍然属于体细胞无性变异的范围，因为性细胞在离体培养条件下已经偏离了配子体的发育途径，突变也不经过有性（杂交）的过程。

第二节 无性系变异及突变体的用途 1，无性系变异 无性系变异的本质是细胞的遗传物质或遗传物质的表达产生了变化，由这些细胞再生的植株是变异植株，也称为变异体或变异个体（variant）。 和变异的定义很接近（但不完全等同）的是突变（mutation）,发生突变的个体称为突变体(mutant)。

第二节 无性系变异及突变体的用途 1，无性系变异 1.1，基本概念 突变（mutation）: 突变是DNA碱基序列所发生的永久性的可遗传的变化。下面两个方面需要注意： 可遗传的变异未必都是突变：例如自然界存在的DNA甲基化也可造成可遗传的变异，但基因的碱基序列并未改变； 有突变表型未必是基因突变：例如RNAi可导致基因沉默（不表达），但并不改变该基因DNA的一级结构。

变异体和突变体 所有的突变体都是变异体 变异体并不都是突变体 变异体中不是突变体的那一部分个体属于“表型变异(epigenetic variation)”，也称为“后生遗传变异”。 在育种中，只有突变体才是有用的。

第二节 无性系变异及突变体的用途 2，体细胞遗传学 2.1，体细胞遗传学的诞生 对体细胞在培养过程中的遗传稳定性和变异的研究诞生了“体细胞遗传学（somatic cell genetics）”，成为“细胞遗传学(cytogenetics)”的一个分支。

第二节 无性系变异及突变体的用途 2，体细胞遗传学 2.2，体细胞遗传学与细胞遗传学的差别 细胞遗传学是遗传学和细胞学相结合的产物，核心内容是研究染色体在减数分裂过程中的行为及其遗传后果； 体细胞遗传学是遗传学、细胞学和组织培养相结合的产物，主要研究离体条件下的体细胞在有丝分裂过程中的遗传规律。

第二节 无性系变异及突变体的用途 3，突变体的用途 3.1，基础理论研究 遗传学研究：例如基因定位；基因分离 (克隆)；功能基因组研究；等 生物学以及生物化学研究：例如发育生物学；代谢途径与调控；等 3.2，实际生产 育种（食品、医药、工业上的应用）

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 正常个体之所以会成为突变体，是因为原来的基因结构产生了变化（如果是基因的表达产生了改变，表达量不足或完全不能够表达，则是变异体）。 突变能够自发产生，但频率一般比较低。为了提高突变频率，常常通过人为的方式进行人工诱变。 人工诱变的方法包括： 物理诱变（physical mutagenesis）和化学诱变(chemical mutagenesis) 生物学诱变(biological mutagenesis)三种方式。

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 4.1，物理诱变 采用X－ray, γ-ray, UV以及太空辐射等，对生物体进行处理，可以诱导突变的产生。 高能电离辐射可造成染色体断裂、易位、倍性改变、点突变等; UV 可使DNA 形成嘧啶二聚体（pyrimidine dimers），从而造成基因突变。 太空育种，复合物理因素的诱变

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 4.2，化学诱变 对细胞进行如下种类的化学试剂处理可以诱导突变： 碱基类似物 具有配对两重性，DNA复制时如掺入碱基类似物可造成碱基配对的错误； 碱基修饰剂 对碱基某些基团进行化学修饰从而改变碱基的配对性质，造成碱基的转换； DNA嵌合剂 可嵌入DNA的碱基对之间，造成复制错误，形成插入突变；

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 4.2，化学诱变 常用的化学诱变剂主要是： 碱基类似物：5－溴尿嘧啶（ BU ）； 2－氨基嘌呤（AP） 碱基修饰剂：亚硝酸（HNO2）；羟胺（HA）； 甲基磺酸乙酯（EMS） 嵌合剂：吖啶橙；原黄素；吖黄素

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 4.3，生物学诱变 这是一类通过分子生物学手段的诱变方法，包括： T-DNA tagging； Transposon tagging； Sense or antisense RNA inactivation； RNA interference

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 4.3，生物学诱变：T-DNA tagging 利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA作为mutagen, 将其插入植物基因组，造成基因的插入突变。这类突变体还可以作为材料进行如下的研究和应用： 突变性状与T-DNA的共分离关系的确定 插入点旁侧的基因组序列分析 以旁侧序列为探针筛选基因组文库，获取全长基因

Gene A T-DNA插入突变 T-DNA Ge ne A 插入点旁侧序列扩增 Ge ne A 筛选文库 Ge 基因组文库中含gene A 的克隆 ne A

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 4.3，生物学诱变：Transposon tagging 将转座成分（transposable element）导入植物，转座成分的插入可造成基因失活。诱导转座子在转化体内不断转座，以形成一个不断扩大的插入突变群体。 这类突变体的应用内容和T-DNA tagging产生的突变体的相同。但这两类诱变方法在产生突变体的数量上有差别。

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 T-DNA tagging 与transposon tagging 的差别 T-DNA tagging：一旦整合在基因组的某个位置后，T-DNA就不能再改变自身的位置，所以要想获得更多的突变体就必须大量转化 Transposon tagging：只要将转座子导入了基因组，转座子就可在转化体内不断发生转座，突变群体会不断扩大，因而无需做大量的转化工作

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 4.3，生物学诱变 正义或反义的RNA失活（Sense or antisense RNA inactivation） 导入正义或反义的RNA可引发同源的基因沉默，这种沉默属于转录后水平的基因沉默 反义的RNA可与内源的正义RNA互补，形成dsRNA，后者在体内极易被识别为外源RNA而被降解

Gene A 反义 mRNA mRNA局部配对 mRNA特异降解

第二节 无性系变异及突变体的用途 4，获得突变体的途径 4.3，生物学诱变 RNA interference (RNAi) RNAi的概念：生物体内导入双链RNA后，引起体内同源基因特异性沉默的现象 用途： 基因敲除（gene knock-out）

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 1，体细胞无性系变异的类型 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 1，体细胞无性系变异的类型 SV类型包括植株或器官形态、生理学和生化学等多方面的变异 SV按遗传背景可分为：染色体数目与结构变异、核基因突变、胞质基因突变

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 2，体细胞无性系变异的特点（略） 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 2，体细胞无性系变异的特点（略） 变异广泛 后代稳定快 可与其他的诱变手段相结合 特别适合进行抗性突变体的筛选

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 3，影响体细胞无性系变异的因素（略） 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 3，影响体细胞无性系变异的因素（略） 材料基因型 染色体的倍数 植株再生方式 外植体的分化程度 培养基中的理化因子 培养物的继代时间

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 4，体细胞无性系变异的筛选方法 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 4，体细胞无性系变异的筛选方法 正选择法：将细胞群体置于某种选择条件下，发生了突变的细胞可生长，而正常细胞生长受到抑制甚至被毒杀死。 正选择法一般用于抗性突变体的筛选，常用的选择条件是添加病原菌毒素、高浓度的某种离子、非正常的高温或低温等，对突变细胞进行直接选择；也有添加某些物质（例如高浓度的脯氨酸选择抗旱突变体）进行间接的选择。

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 4，体细胞无性系变异的筛选方法 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 4，体细胞无性系变异的筛选方法 负选择法：适用于营养缺陷型突变体的筛选 在正常的培养基上，正常细胞可分裂增殖而营养缺陷型的细胞（例如细胞自身不能够合成丝氨酸）则因为缺少必需的营养而不能够分裂和增殖。 在正常培养基中加入某些仅能够毒害进行分裂的细胞的物质，把正常细胞毒死。虽然突变体不能够在这种培养基上分裂生长，却可以免于被毒死而得到选择。 前提：需要采用添加某种特定物质（例如丝氨酸）对细胞群体进行增殖培养。

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 5，影响筛选效果的因素（略） 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 5，影响筛选效果的因素（略） 亲本材料的染色体倍数 培养方式（愈伤组织、悬浮细胞团、单细胞或游离成为原生质体） 选择压（种类、剂量、次数）

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 6，筛选结果的验证 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 6，筛选结果的验证 6.1，需要进行验证的理由： 由选择得到的“变异细胞”再生的植株可能没有能够表现出“变异的性状”（生理适应性）； “变异植株”的有性后代失去了变异性状，或无性后代的“变异的性状”逐渐消失（表型变异而非突变）； 再生植株为嵌合体；

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 6，筛选结果的验证 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 6，筛选结果的验证 6.2，验证的方法 诱导再生产生新植株：从变异植株上取外植体进行组织培养，不施加筛选压诱导再生，对再生植株进行栽培观察。 取得再生植株的种子并进行种植：观察目标性状表现（有性后代产生分离，部分后代个体失去了“变异的性状”是真正的变异的证据）。

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 7，无性系变异筛选和利用存在的问题（略） 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 7，无性系变异筛选和利用存在的问题（略） 7.1，自发突变和诱发突变的随机性 7.2，某些基因高度稳定 7.3，多数变异性状难以在细胞水平进行选择 7.4，细胞水平和个体水平表现的不一致性 7.5，细胞的生理适应性和突变的混淆

第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 8,无性系变异育种程序（略） 第三节 体细胞无性系变异与变异体筛选 8,无性系变异育种程序（略） 品种的确定:良种\培养反应好 材料的确定:染色体倍数 培养方式的确定:脱分化\悬浮培养细胞\原生质体 诱变策略的确定:化学或物理诱变\长时间继代培养 筛选和确认:变异的性质 应用:无性繁殖直接应用\有性繁殖自交选择应用

本章小结 细胞悬浮培养的特点和作用 体细胞突变在育种中具有重要的应用价值，但用来进行转基因和进行大量种苗繁殖的过程中则应避免细胞突变的发生。

复习思考题 液体培养基悬浮培养和固体培养基培养有哪些方面的差别？ 如何开展突变体育种的工作，需要采用什么措施以提高效率？同时，需要注意哪些方面的问题？