第十二章 核酸的生物合成 第一节 DNA的生物合成 第二节 RNA的生物合成 第三节 反转录作用（逆转录） 一、DNA的复制方式～半保留复制 一、 转录 二、转录过程的选择性抑制 第三节 反转录作用（逆转录）

一、DNA的复制方式～半保留复制 （一）概念： （二）DNA半保留复制的证据 （三）DNA复制的必备条件 （四）DNA复制的起始点和复制方向

DNA复制的可能方式 半保留复制 全保留与全新复制 分散复制

一、DNA的复制方式～半保留复制 （一）概念： 每个子代DNA分子的一条链来自亲代的DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为DNA的半保留复制。 半保留复制的假说是1953年沃森和克里克在DNA双螺旋结构的基础上提出的。

（二）DNA半保留复制的证据 1958年Meselson（麦尔逊）和Stahl（斯坦赫）将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记， 然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。

氯化铯梯度离心法（平衡密度梯度离心法） 用超离心机对小分子物质（惰性介质）溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子（样品）溶液，当溶液中不同的大分子颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同的区域形成区带。

实验证据 普通DNA的沉降位置 证明DNA的复制是半保留复制 证明DNA的复制是半保留复制

亲代DNA（15N～15N） 子一代DNA（15N～14N） 子二代DNA (15N～14N，14N～14N 1:1) 氯化 铯梯 度离 心 亲代DNA与子二代DNA的混合物 亲代DNA与子四代DNA的混合物

（三）DNA复制的必备条件 底物： dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP) 聚合酶： DNA聚合酶（DNA依赖的DNA聚合酶) 引物：　 寡核苷酸引物（RNA片段) 其他酶和蛋白质因子： 解链酶，解旋酶（拓扑异构酶），单链结合蛋白，连接酶　　

1、DNA聚合酶 机体内以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成DNA的一类酶。 DNA聚合酶的反应特点： 以四种脱氧核苷三磷酸为底物 反应需要接受DNA模板的指导 反应需要有引物3′-OH的存在 DNA的生长方向为5′- 3′ 产物DNA的性质与模板相同

单体酶，多肽链中含有一个锌原子，属于多功能酶 原核生物DNA聚合酶 ① DNA聚合酶Ⅰ 单体酶，多肽链中含有一个锌原子，属于多功能酶 功能 聚合作用： 使DNA链按5′—3′方向延长。 校对功能（核酸外切酶作用）：具有3′—5′核酸外切酶活性：能切除单链DNA 3′末端核苷酸。对双链无作用。 具有5′— 3′核酸外切酶活性：它只作用与DNA 的碱基配对部分，由5′端水解下核苷酸或寡核苷酸。 主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切 除及其空隙的填补）

图：DNA聚合酶催化的反应

DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读 A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。

DNA-pol Ⅰ DNA聚合酶活性   5 核酸外切酶活性 C 端 木瓜蛋白酶 小片段 大片段/Klenow（克列诺) 片段 323个氨基酸 604个氨基酸 5  核酸外切酶活性 DNA聚合酶活性   5 核酸外切酶活性 Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

② DNA聚合酶Ⅱ： 聚合作用活力较低。仅有3′—5′的外切 酶的作用。 多亚基酶 ③ DNA聚合酶Ⅲ： 聚合和校对作用均有，且活力最高。 多亚基酶。是原核生物DNA复制的主要聚合酶 结论：三种聚合酶均具有聚合和校对的作用。 而且具有方向性。

大肠杆菌三种DNA聚合酶的性质比较 DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅱ DNA聚合酶Ⅲ 亚基数 1 ≧7 ≧10 3′—5′核酸外切酶 + 5′— 3′核酸外切酶 - 聚合速度（核苷酸/分) 1000~1200 2400 15000~60000 持续合成能力 3~200 1500 ≧5000000 功能 切除引物，修复 修复 复制 DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。使修复缺乏准确性，造成高突变率的出现。

真核细胞DNA聚合酶 只有聚合作用 在高等真核细胞已分离到的DNA聚合酶有五种α、β、γ、 δ 、 ε 。 真核细胞DNA聚合酶与细菌DNA聚合酶的性质相似，聚合反应所需的条件也完全一样，所不同的是在真核细胞中的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶作用。 只有聚合作用

真核细胞内有五种DNA聚合酶 DNA聚合酶α DNA聚合酶β DNA聚合酶γ DNA聚合酶δ DNA聚合酶ε 细胞核 线粒体 4 1 2 定位 细胞核 线粒体 亚基数目 4 1 2 3-5 聚合酶活性 5’ →3’ + 外切酶活性 3’ →5’ - 引物合成酶活性 持续合成能力 中等 高 有PCNA时高 功能 引物合成 修复 线粒体DNA合成 核DNA合成

PCNA： 增殖细胞核抗原，该抗原与DNA聚合酶δ结合可增加该酶持续合成能力。

强调： DNA连接酶不能将两条游离的DNA单链 连接起来。 功能：DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5’-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 强调： DNA连接酶不能将两条游离的DNA单链 连接起来。 功能：DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。

5’ P O O- -O 3’ 3’ HO 5’ ATP DNA连接酶 ADP 5’ 3’ P O -O O- 3’ 5’

3、引发酶 促进引物合成的酶为引发酶。 如以RNA片段为引物，则促进RNA片段合成 的引发酶为RNA聚合酶。

4、复制中解链必需因子 （1）解链酶（解双螺旋酶） 解链，为SSB提供可结合的单链区。 （2）单链结合蛋白（SSB） 作用：与单链结合，保护复制中的DNA单链部分不被核酸酶降解；刺激同源聚合酶的活力。

（3）DNA拓扑异构酶(解旋酶） 既能水解，又能连接磷酸二酯键 拓扑酶Ⅰ： 拓扑酶Ⅱ：

10 8 局部解链后 拓扑异构酶Ⅰ的解旋作用

拓扑异构酶Ⅱ解链作用

作用机制 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 拓扑异构酶Ⅰ 反应不需ATP。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。 拓扑异构酶Ⅱ

（四）DNA复制的起始点和复制方向 1、DNA复制的起始点 起始点：起始点是含有100～200个碱基对的一段特殊的DNA序列。为DNA复制的起始部位 。原核细胞基因组、质粒、许多噬菌体、某些病毒的DNA及真核细胞器DNA一般仅含一个起始点 ，真核生物含有多个起始点。

2、复制叉与复制方向 复制叉（生长点）：DNA复制时，从起始点开始，两条链解开，已解开的两条链与未解开的双链间形成一个在显微镜下可见的叉状结构，称为复制叉。随着复制叉的移动完成DNA的复制。 复制方向： 单向复制—复制时形成一个复制叉 ※双向复制--复制时形成两个复制叉

（1）环状DNAQ式复制 多以Q式方式复制（单复制子） 复制叉从起始点向一个方向移动，随着复制叉的移动完成复制。 单向复制： 双向复制： 复制时首先在起始点裂开，复制叉从起始点开始向两个相反方向移动直到两个复制叉相遇完成复制。 需要说明的是：在迅速生长的原核生物中，第一个染色体DNA分子复制尚未完成，第二个DNA分子就在同一个起始点上开始复制，其复制叉移动的速度是相当快的，每分钟约为105个碱基对。

C A B ori A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 从起点开始向两个相反的方向解链，形成两个复制叉。

（2）真核生物线状DNA的复制 染色体不同位置上有多个起始点；形成多个复制泡；因此是多复制子。从这些起始点开始复制叉向相反的方向移动，使DNA复制双向进行，完成复制。复制叉移动的速度较慢5x102～5x103碱基对，但由于同时起作用的复制叉数目很大，所以真核生物染色体DNA复制的总速度比原核生物要快。

习惯上把两个相邻起始 点之间的距离定为一个复 制子 。复制子是独立完 复制子 成复制的功能单位。 5’ 3’ ori 5’ 3’ 3’ 5’

起点 延伸 复制叉 5' 3' 随后链 领头链 3' 5' 领头链 随后链 延伸 复制叉 起点 DNA的双向复制

二、DNA复制的机制—半不连续复制 （一）半不连续制的发现： 1968 日本 冈崎 【试验1】 1968 日本 冈崎 【试验1】 用3H -dT标记噬菌体T4感染的大肠杆菌，分离标记的DNA产物，短时间内分离的DNA均为DNA小片段，一段时间后检测到的是DNA大片段。这一结果说明小片段是复制过程的中间产物。

【试验2】 如果用DNA连接酶的缺失变异株进行上述试验，结果检测到大量DNA小片段的积累。证明DNA复制中有小片段合成。大片段是由连接酶连接而成的。但还无法判断不连续合成是发生在一条链上，还是两条链上。

【试验3】 用缺乏糖苷酶的大肠杆菌变异株进行试验时，发现大约有一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。另一半直接进入大片段中。这一结果证明DNA在复制时，一条链是连续合成的，另一条链是不连续合成的。

（二）半不连续复制 1、含义 : DNA在复制时，由双链分开的两条模板链上，两条新链是按5ˊ—3ˊ方向合成，其中一条链（前导链）是连续合成的，另一条链（滞后链)则是先合成短的片段（冈崎片段），然后再将片段连接起来形成新链，这个复制过程为半不连续复制。

DNA复制的半不连续性 前导链：从起始点开始，以复制叉向前移动的方向为标准，以3’ → 5’ 方向的亲代链为模板连续合成的子代链。 前导链 冈崎片段 滞后链：从起始点开始，以复制叉向前移动的方向为标准，以5’ →3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。 滞后链

三、DNA复制过程 （1）合成起始 — 引发 （2）DNA片段的合成及链的延伸 （3）合成终止

（一）原核生物DNA的复制 1、复制的起始： 需要解决两个问题： DNA解开成单链，提供模板。 合成引物，提供3-OH末端。

大肠杆菌DNA复制起始的结构 由245bp构成，序列十分保守。整个序列中有两组短的重复序列，一组是成串排列的三个13bp序列和4个9bp反向重复序列。4个9bp反向重复序列为DnaA蛋白质的结合位点，20~40个DnaA蛋白四聚体在ATP参与下与9bp反向重复序列结合，并聚集在一起，DNA缠绕其上，形成起始复合物。HU蛋白可与DNA结合，促使双链弯曲。受其影响，邻近三个13bp序列被变性，成为解链复合物，此过程耗能。然后DnaB（解螺旋酶）蛋白四聚体在DnaC蛋白参与下结合于解链区，并按5′-3′方向移动，使双链解开形成复制泡和两个复制叉。多个SSB蛋白同时与单链结合，稳定单链DNA。

（1）起始复合物生成 DnaA蛋白结合位点 串联重复序列 反向重复序列 5 3 E.coli复制起始点oriC GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 1 13 17 29 32 44 DnaA蛋白结合位点 13个bp 串联重复序列 反向重复序列 5 3 ···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 245 9个bp E.coli复制起始点oriC

（2）引发体组装，DNA解链 DnaC 3 DnaA 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 DnaB（解旋酶） DnaC 3 DnaA DNA拓扑异构酶 引物酶 5 3 5 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。作用：置换SSB蛋白，并按5′-3′方向合成RNA引物。

（3）合成引物 3 3' HO 5' 引物酶 引物 5 3 5' 3‘- HO 引物酶 5

2、DNA片段的合成及链的延伸 在RNA引物上由DNA聚合酶Ⅲ催化，按照模板3ˊ— 5ˊ链上的顺序，在引物3ˊ—OH端接上相应的核苷酸。新链的合成按5ˊ—3ˊ方向进行（即前导链的合成）。与此同时与另一条链5ˊ—3ˊ为模板，合成冈崎片段，每一个冈崎片段5ˊ末端带一个引物，这条链为滞后链。 5' 3' DNA-poⅢ 5' OH 3' 3' dATP dGTP dTTP dCTP

前导链的合成

滞后链的合成

3、合成终止 ①引物的切除 被特异核酸酶切除 ②空缺部位的填补与连接 ①引物的切除 被特异核酸酶切除 ②空缺部位的填补与连接 由DNA聚合酶Ⅰ催化DNA片段合成，以补充核苷酸数，最后由连接酶将片段连接起来，从而形成两条连续的新链。

滞后链上不连续性片段的连接 5 5 RNA酶 5 DNA-pol Ⅰ dNTP 5 ATP DNA连接酶 ADP+Pi 5 OH

DNA 复 制 的 过 程

（二）真核生物DNA复制 真核生物DNA复制与原核生物DNA复制共同点表现在哪些方面？在复制中二者存在的主要区别有哪些？

共同点 1、复制方式均为半保留复制。 2、复制机制均为半不连续复制。 3、均需要解螺旋酶解开双螺旋，并由SSB同单链区 结合。 4、均需要拓扑异构酶消除解螺旋形成的扭曲张力。 5、均需要RNA引物 6、新链合成均有校对作用。

主要区别 1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。 2、复制叉移动的速度：真核生物比原核生物移动的慢（50nt（核苷酸数）/s，900nt/s）。 3、冈崎片段的大小：原核生物比真和生物的长（1000-2000nt，100-200nt）。

4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；但在快速生长时，往往采用更多的复制起点。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。

5、真核生物DNA聚合酶和蛋白质因子比原核生物多，引物酶活性由DNA聚合酶α的两个小亚基承担。

6、真核生物线性染色体末端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。当复制叉到达线性染色体末端时，复制过程在端粒酶催化下完成。

指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。 端粒(telomere) 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。 结构特点 • 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 • 末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短 序列。 TTTTGGGGTTTTGGGG… 功能 • 维持染色体的稳定性 • 维持DNA复制的完整性

DNA聚合酶复制子链 进一步加工

总结： 1、DNA的复制方式： 半保留复制。 2、复制时有固定的起始点。 3、复制方向： 双向或单向。多数是双向的。双向复制时两个复制叉移动的速度不一定相同。 4、复制的速度取决于起始。 5、复制链延长的方向： 每条链都由5ˊ端向3ˊ端延长。

6、复制的过程是半不连续的，前导链是连续合成的，滞后链是不连续合成的。相邻近的DNA片段由连接酶催化连接成新链。 7、DNA复制是在RNA引物上起始的。前导链只需一个引物，滞后链每合成一个冈崎片段需要一个引物。RNA引物以后被酶切除。 8、复制有多种机制。即使在同一细胞里，可能因环境、温度、营养条件、酶的丰富程度、dNTP供应是否平衡，模板是否被外界因素损伤等不同。复制也可以采取不同的方式。 9、生物系统的遗传信息主要是贮存在DNA分子中，表现为特异的核苷酸顺序。

四、DNA的损伤（突变）与修复 （一）DNA的损伤：DNA在某些因素的作用下引起不同程度的双螺旋结构的破坏为DNA的损伤。 生物因素:自发性的碱基错配、复制错误等 1、引起DNA损伤的因素 物理因素 如：紫外线 电离辐射等 化学因素 如：化学诱变剂 DNA的碱基 2、破坏的部位 糖或是磷酸二酯键

3、损伤的分子改变类型 错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement) 导致框移突变

（1）碱基错配（点突变） DNA分子上的碱基错配称点突变。 转换 发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。 颠换

举例 正常成人Hb (HbA)β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · · · C 肽链 CTC GAG 基因 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · · · C 肽链 CAC GTG 基因

（2）缺失、插入和框移 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。 插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。 缺失或插入都可导致框移突变 。 框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

举例 缺失引起框移突变 C 正常 缺失C 5’ ……G A G U A C A U G U C …… 丙 缬 组 缬 丙 缬 组 缬 缺失C 5’ ……G A G U A C A U G U C …… 谷 酪 蛋 丝

（3）重排 DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

损伤的结果：造成结构与功能的破坏，进而引起突变，甚至导致生物的死亡。

（二）DNA损伤的修复 错配修复 直接修复 如：光复活修复 切除修复：发生在DNA复制之前 修复系统 重组修复：修复发生在DNA复制之后 应急反应和易错修复

1、紫外光对DNA损伤的光复活修复的机制 可见光 二聚体 光复活酶 1、损伤 2、形成酶 DNA复合物 3、二聚体被分解 4、酶释放 紫外线 可见光 二聚体 激活 光复活酶 1、损伤 2、形成酶 DNA复合物 3、二聚体被分解 4、酶释放 光复活修复属于直接修复。光复活酶在生物界分布广泛，从低等单细胞一直到鸟类都有，高等哺乳类没有。该修复在植物中尤为重要

2、切除修复 切除修复是在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损的部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切除的部分，使DNA恢复正常结构的过程。

2、切除修复 是细胞内最重要和有效的修复机制，先由内、外切酶作用切除错误部分，再由DNA-polⅠ和连接酶完成修复。 UvrA UvrB UvrC 是细胞内最重要和有效的修复机制，先由内、外切酶作用切除错误部分，再由DNA-polⅠ和连接酶完成修复。 OH P DNA聚合酶Ⅰ OH P E.coli的切除修复机制 DNA连接酶 ATP

细胞切除修复系统与癌症的发生有一定的关系。有一种着色性干皮病的遗传病，这种病患者对日光或紫外线特别敏感，往往容易出现皮肤癌。分析表明：着色性干皮病的患者皮肤细胞中缺乏核苷酸切除修复有关的酶，因此对紫外线引起的损伤不能修复。这说明切除修复系统的障碍可能是癌症发生的一个原因。

3、重组修复 重组修复是指从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链空缺的过程。该过程发生在复制之后。如DNA的双链断裂、模板链遭损伤，单链损伤而无正常互补链等情况下将导致重组修复。

异常的DNA子链 正常的DNA母链

第二节 RNA的生物合成 一、转录 （一）转录作用及特点 由DNA指导的RNA合成， DNA以碱基互补原则，决定合成RNA的全部碱基成分及排列顺序，将DNA模板上的遗传信息传递到RNA分子的过程为转录作用。转录是在一个转录单位之间完成的。 特点：1、反应体系： DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+，其它蛋白因子。 2、合成方向5’3’。 3、连接方式：3’ , 5’磷酸二酯键。

转录单位：RNA链的转录起始于DNA模板的一个特定起点，终止于另一个终点。此转录区域为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因，也可以是多个基因。

4、转录为不对称转录 DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录。 模板链及反意义链：指导RNA合成的DNA模板链。 编码链及有意义链：不作为转录的另一条DNA链。 由于基因分布于不同的DNA单链中，即某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。

图 12-1 转录作用

（二）RNA聚合酶     1、原核细胞RNA聚合酶（目前以大肠杆菌的RNA聚合酶研究的最清楚）

大肠杆菌的RNA聚合酶 核心酶 (core enzyme) 全酶 (holoenzyme)       

大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的性质与功能 亚基 Mr 亚基数目 功能 α 40,OOO 2 决定哪些基因被转录 β 155,000 1 结合核苷酸底物，催化磷 酸二酯键形成 β’ 160,000 1 与模板结合 σ 32,OOO-92，000 1 识别启动子，促进转录的起始  9,OOO 1 未知 注：存在于全酶制剂中，核心酶没有

2、真核生物RNA聚合酶 RNA聚合酶I 存在于核仁，催化rRNA前体的合成 RNA聚合酶II 三种 存在于核质，催化mRNA前体的合成 RNA聚合酶III 存在于核质，催化tRNA前体的合成

复习 1、转录作用与转录单位 以DNA为模板合成RNA的过程，称之为（ ）。 DNA的（ ）决定RNA的（ ）。转录是在一个（ ）之间完成的。 转录作用 碱基序列或核苷酸序列 碱基序列或核苷酸序列 转录单位

2、转录特点 （1）反应体系： DNA模板,NTP,酶，Mg 2+,Mn2+，其它蛋白因子。 （2）合成方向： 5ˊ3ˊ （3）连接方式（连接键）： 3ˊ， 5ˊ磷酸二酯键 不对称转录 （4）转录形式：

3、RNA聚合酶的特点： 反应底物：NTP，DNA为模板、Mg2+促进聚合反应。 RNA聚合酶不需要引物，合成方向53 。 RNA聚合酶表现其活性需要DNA模板，天然（双链）DNA作为模板比变性（单链）DNA更为有效。 RNA聚合酶能局部解开ＤＮＡ的两条链。

（三）转录过程（以大肠杆菌为例） 起始位点的识别 转录起始 链的延伸 转录终止

1、起始位点的识别 RNA的合成不需要引物。体外实验证明，不含σ因子的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有σ因子时就会选择正确的起点。 证明：σ因子具有识别DNA分子上的起始信号或启动子的作用。

RNA-pol 原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游的调控序列。 53 35 结构基因 调控序列 RNA-pol RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。

原核生物启动子保守序列 RNA聚合酶保护区 结构基因 5 3 5  3  开始转录 -35 区 -10 区 T T G A C A -30 -50 10 -10 -40 -20 5  3  开始转录 -35 区 -10 区 T T G A C A A A C T G T T A T A A T Pu A T A T T A Py RNA-pol辨认位点 (recognition site) (Pribnow box) 原核生物启动子保守序列

2、转录起始 转录起始需解决两个问题： RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。

2、转录起始：三元起始复合物生成 　　　RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点（第一个核苷三磷酸掺入的位置为转录起始点），然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。形成启动子、全酶和核苷三磷酸复合物（称为三元起始复合物）。第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点， σ亚基就会被释放脱离核心酶。（请看下图）

因子仅与起始有关，RNA的合成一旦开始，便被释放 5’ 3’ 模板链 pppG或pppA

3、转录延长（RNA链的延伸） （1）亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移； （2）在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。 (NMP) n + NTP  (NMP) n+1 + PPi

（1）由DNA的终止信号作用而发生合成终止。 ４、转录终止 （1）由DNA的终止信号作用而发生合成终止。 当RNA聚合酶移动到模板DNA特定的核苷酸序列时合成即告终止。这一特定的核苷酸序列为终止信号或终止位点。这一合成终止与蛋白质无关，仅由这个部位的特殊结构决定的。

（2）由蛋白质ρ因子引起的合成终止。 合成终止是通过一种特殊的蛋白因子—ρ因子引起的。在大肠杆菌和某些噬菌体的DNA上存在着ρ因子结合位点，当与RNA聚合酶结合的ρ因子与ρ位点结合时，合成终止。最后形成成熟的mRNA或各种RNA的前体。 ＤＮＡ经转录后仍以全保留的方式保持双螺旋结构。

（五）真核生物RNA的转录 真核生物转录的基本过程与原核生物相似，但真核生物有三种RNA聚合酶，转录步骤和转录调控更加复杂。其过程大致可分为装配、起始、延伸和终止。

真核生物转录的基本要件： RNA聚合酶 反式作用因子（如：转录因子） 顺式作用元件 四种核苷三磷酸

三类RNA聚合酶功能比较 酶 功能 RNA聚合酶Ⅰ 转录45SrRNA前体，经加工产生5.8S、18S、28SrRNA。 RNA聚合酶Ⅱ 转录所有编码蛋白质的基因和大多数核内小RNA（snRNA）。 RNA聚合酶Ⅲ 转录小RNA的基因，包括 tRNA、5SrRNA、U6snRNA和scRNA 这三类RNA聚合酶都能依赖模板合成RNA，但都不能直接识别启动子和起始转录。帮助聚合酶识别启动子的一些反式作用因子。

U6snRNA：是一种核内最小的RNA。大约有100个核苷酸。 snRNA与scRNA：分别是核内小RNA胞浆小RNA 启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。

顺式作用元件 真核生物中参与转录调控的DNA序列。如：启动子、增强子、沉默子等。

反式作用因子 能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子（TF)。

参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ

1、转录起始 真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。

（1）转录起始前的上游区段 顺式作用元件 结构基因 真核生物启动子保守序列 转录起始 增强子 TATA盒 CAAT盒 GC盒 -GCGC---CAAT---TATA 增强子 GC盒 CAAT盒 TATA盒 转录起始 真核生物启动子保守序列

（2）转录起始复合物的形成 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子帮助间接结合到DNA分子上。在真核生物的转录起始阶段，由转录因子、RNA聚合酶、启动子共同形成的复合物称为转录起始复合物。

起始复合物形成的基本过程 TBP辅因子 DNA TATA polⅡ TFⅡF TAF TAF TFⅡH TFⅡA TBP TFⅡB （1）TBP识别TATA序列 （2）TBP再与两个大的TAF结合 （3）TFⅡA与TAF结合，解除TAF对TBP的抑制 （4）TFⅡB松散地结合在TATA框下游并与附近的TBP结合 （5）TFⅡF与RNA聚合酶Ⅱ结合形成全酶复合物并与TFⅡD（TBP和TAF）结合。 （6）TFⅡE和TFⅡH与起始复合物结合（二者与起始无关，与下一步的延伸有关。 TBP辅因子 polⅡ TFⅡF TAF TAF TAⅡE TFⅡH TBP TFⅡA TFⅡB TATA DNA

（二）转录延长 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。

转录延长中的核小体移位 核小体 RNA-Pol 转录方向 RNA-Pol RNA-Pol

（三）转录终止 —— 和转录后修饰密切相关。 3加尾 RNA-pol 3 核酸酶 5 5 3 转录终止的修饰点 5 ------AAUAAA-- AAAAAAA······ 3 mRNA 3加尾 5------AAUAAA- 核酸酶 -GUGUGUG RNA-pol 5 3 5 AATAAA GTGTGTG 3 转录终止的修饰点

都以三磷酸核苷酸为底物（NTP或dNTP） 转录与DNA复制的比较： 都需要模板 相同点 都以三磷酸核苷酸为底物（NTP或dNTP） 合成方向都是5’→3’

转录与DNA复制的不同点 1、转录不需引物； 2、转录并不是DNA的全部转录，只是DNA分子中的一个片段（称为转录单位或操纵子）进行转录； 4、一条链上具有某些基因的模板链和另一些基因的编码链。 5、哪个基因被转录与特定的时间、空间、生理状态有关。 6、RNA聚合酶无校对功能。

5′···GCAGTACATGTC ···3′ 编码链 3′··· c g t g a t g t a c a g ···5′ 模板链 转录 mRNA 5′···GCAGUACAUGUC ···3′ 翻译 N······Ala · Val · His · Val ······C 蛋白质

结构基因 转录方向 5 3 3 5 编码链 模板链 模板链 编码链 转录方向

（五） rRNA、tRNA 、mRNA的合成（转录后的加工） 在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。

几种主要的修饰方式 1. 剪接(splicing) 2. 剪切(cleavage) 3. 修饰(modification) 4. 添加(addition)

１、核糖体RNA（rRNA）转录后的加工 （1）原核生物中rRNA前体的加工 原核生物刚转录的rRNA为30S，先在特定的碱基上进行甲基化（核糖2-羟基）修饰，后逐步裂解（核酸酶的切割）。

甲基化 切割 16S tRNA 23S 5S 5SrRNA前体p5 16SrRNA前体p16 23SrRNA前体p23 5SrRNA

在真核生物中存在的5SrRNA是通过另外途径生成的 。 甲基化和酶切 28S 26S 17S 5.8S 45S 或38S 37S 18S 5.8S 在真核生物中存在的5SrRNA是通过另外途径生成的 。

２、tRNA前体的加工 （1）断裂和修剪：即tRNA前体中的多余的核苷酸被高度专一的酶切除，产生与成熟tRNA分子同样长短的核苷酸链。 修饰作用主要是甲基化，脱氨和还原作用等。

TGGCNNAGTGC GGTTCGANNCC DNA RNA pol Ⅲ tRNA前体

RNAaseP、内切酶

tRNA核苷酸转移酶、连接酶 ATP ADP

碱基修饰 （1）甲基化 如：A  Am （2）还原反应 如：U  DHU （3）核苷内的转位反应 如：U  ψ （4）脱氨反应 如：A  I （4） 目 录

３、mRNA转录后的加工* （1）原核生物mRNA合成的特点： ②转录和翻译相偶联

（2）真核生物mRNA转录后的加工 真核生物mRNA的合成，一般是单顺反子转录（即一个结构基因转录在一个mRNA分子上）；转录在核内，翻译在胞浆内。二者不相偶联。转录后mRNA的前体是不均一核糖核酸RNA（hnRNA）需要进一步进行加工修饰转化为mRNA。

加工包括： （1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列拼接上(真核生物一般为不连续基因)。 （2）3 ′端添加polyA “尾巴”； （3）5′端连接“帽子”结构（帽子是通过三磷酸键连接在mRNA5‘端核苷酸残基上的7′-甲基鸟苷）； （4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。

帽子结构

mRNA的剪接 hnRNA 和 snRNA 核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hnRNA) 核内小RNA ( snRNA) snRNA 核内的蛋白质 小分子核糖核蛋白体 （snRNP ） snRNA

断裂基因(splite gene) C A B D 真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。 C A B D 非编码区 编码区 A、B、C、D

二、转录过程的选择性抑制 1、抗菌素放线菌素D：为原核生物和真核生物中RNA聚合酶的专一抑制剂。抑制完整细胞和细胞提取物二者中新生成RNA链的延长。

2、利福平 从利福霉素B得到的一种半合成抗生素。能抑制细菌DNA转录合成RNA，可用于治疗结核病、肠球菌感染等。除作为抗生素应用外，在分子生物学中可用做从细菌中去除质粒的试剂。 3、α-鹅膏蕈碱：来自伞蕈的一种毒素，有α、β、γ和ε等类型。通过RNA聚合酶Ⅱ阻断真核生物细胞RNA的生物合成

RNA生物合成总结 1.转录 转录是DNA分子中遗传信息转移到RNA分子的过程。更具体地说转录是以DNA为模板，在DNA指导的RNA聚合酶催化下，由四种核苷三磷酸合成RNA的过程。 2.转录不需引物；转录具有选择性和不对称性。 3.RNA聚合酶只有聚合功能而无校对功能。

4.转录过程包括 起始位点的识别（或装配）， 转录起始， 链的延伸， 转录终止。 5.起始阶段所需的全部DNA序列为启动子。它是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。 原核生物RNA聚合酶的σ因子具有识别DNA分子上的起始信号或启动子的作用。

6.启动子、全酶和核苷三磷酸复合物（称为三元起始复合物）的形成称为转录起始（原核生物），真核生物中启动子、转录因子和RNA聚合酶形成起始复合物。

7、RNA链在RNA聚合酶的催化下按5‘-3’方向的延伸。 8、在DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的DNA序列称为终止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并释放出RNA。 9、蛋白质ρ因子可引起的合成终止 10、 rRNA、tRNA 、mRNA的合成后，除原核生物的mRNA外，其它RNA均需转录后的加工。

第三节、反转录作用（逆转录） 定义: 以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。催化逆转录反应的酶最初实在致癌RNA病毒中发现的。迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。

※逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿5′3′方 病毒RNA的逆转录过程 （以前病毒形式引起整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化） 逆转录酶 逆转录酶 RNA+ RNA+ + DNA- DNA- DNA+ 单链病毒RNA RNA-DNA杂交分子 双链DNA（前病毒） ※逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿5′3′方 向合成DNA，并要求短链RNA作引物。

逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性： RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5’3’和3’ 5’两个方向起核酸外切酶的作用。

cDNA(complementary DNA)：几乎所有真核生物mRNA分子的3′末端都有一段polyA,当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。

逆转录酶发现的理论和实践意义： 不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。 1983年，发现人类免疫缺陷病毒（human immune deficience virus,HIV）,感染T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（ acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）