Enzyme PART 3

Outline： 1. 酶活性的调节 2. 酶的共价修饰调节 3. 酶原的激活 4. 酶的应用

1. 酶活性的调节 酶在细胞内工作的状态类似生产流水线一样，细胞内每秒 钟都发生着成千上万种酶催化的反应； 各种不同的酶之间的相互协作和影响，以及酶活性的调控 对于细胞的正常工作是非常重要的； 不合适的表达或激活导致细胞的癌变或死亡！

1. 酶活性的调节 Allosteric regulation（别构调节） Homoallostery（同促别构） Heteroallostery（异促别构） Substrate Level Control（底物水平控制） Feedback Control（反馈控制） Isozyme（同工酶）

1.1 别构调节 别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共 价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态。 别构酶：具有别构现象的酶。 别构剂：能使酶分子发生别构作用的物质。 （1）同促别构---底物分子本身对别构酶的调节作 用，表现为底物与酶结合的协同性； （2）异促别构--- 非底物分子对别构酶的调节作用。

1.1 别构调节 活性中心 别构调节中心 别构酶同时具有 同促别构酶的活性中心和别构调节中心是一样的。

1.1.1 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase） Aspartate carbamoyltransferase (Asp转氨甲酰酶 ，aspartate transcarbamoylase or ATCase) 是一个研究别构调节的经典的例子。 Aspartate + Carbamoyl Phosphate<=> Carbamoyl Aspartate 氨甲酰磷酸 氨甲酰ASP ATCase是嘧啶核苷酸(CTP)生物合成多酶体系反应序列中的第一个酶

1.1.1 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase） 氨基甲酰磷酸合酶 氨甲酰磷酸 氨甲酰Asp

1.1.1 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase） 天冬氨酸转氨甲酰酶的活性被终产物CTP抑制，ATP则可以激活其活性。 The Vmax are all not altered CTP-降低酶与底物的亲和性 ATP-增加酶与底物的亲和性 ATP 与CTP相互竞争调节部位 Q：ATP和CTP调节ATCase的生物学意义？

1.1.2 CTP合成在不同的物种中存在不同的调节方式 有的情况下，不同的物种通过调节不同的方式来调节同一条通路。 Bacteria： ATCase 是最重要的控制点； Eukaryotes真核细胞： 调节氨甲酰磷酸的合成量； Mammals：氨基甲酰磷酸合酶II is inhibited by UDP, UTP, CTP, dUDP, and UDP-glucose.

1.1.3 ATCase的四级结构 Tensed State ATCase is a multisubunit protein consisting of 6 catalytic subunits and 6 regulatory subunits 3R2+2C3 R6C6 Relaxed State

1.1.3 ATCase的四级结构 E.coli的ATCase的亚基排列 c:催化亚基（catalytic subunit） 俯视 垂直 E.coli的ATCase的亚基排列 c:催化亚基（catalytic subunit） r:调节亚基（ regulative subunit）

1.1.4 ATCase的变构过渡作用 PALA  T(tense) - 态 C R(relax) -态 双底物类似物 低催化活性构象 R R R R R R 高催化活性构象 R(relax) -态 R R PALA 

1.1.5 别构酶的动力学 S形曲线（正协同） 表观双曲线（负协同效应）

1.1.6 协同指数 Cooperativity index(CI)，协同指数 /Saturation ratio (Rs)，饱和率 鉴别不同的协同作用以及协同的程度。N：协同系数（Hill系数） 典型的米氏类型的酶－－ｎ＝１， Ｒｓ＝８１ 正协同效应的别构酶－－ｎ>１，　Ｒｓ<８１ 负协同效应的别构酶－－ｎ<１，　Ｒｓ>８１

1.1.7 Homoallostery (同促别构) Modulators ---- 底物分子 ---动力学表现为S型曲线 活性位点 调节位点 是相同的 [S]0.5 or K0.5 --- 指的是别构酶催化反应达到最大反应速率一半时的底物浓度。（和非别构酶相区别）

1.1.7 Homoallostery (同促别构) 酶结合一分子底物后，构象发生变化并增加对后续底物分子的亲和性。 Extreme homoallostery At concentrations of S below a critical point, [S]c, the enzyme is almost inactive, but then changes activity rapidly with concentrations of S greater than [S]c.

1.1.8 Heteroallostery(异促别构) 异促别构的效应分子 ： Metabolites (Inhibitors or Activators) Activators----shifts toward the R state--- increase the velocity for a given substrate concentration Inhibitors----shifts toward the T state---- decrease the velocity for a given substrate concentration

1.1.8 Heteroallostery(异促别构) ---别构效应物分为两类：K型和V型 A less common type of modulation, Vmax is altered K0.5 is nearly constant. V-type effector Positive modulator (+) Negative modulator (-) K0.5 is altered without a change in Vmax K –type effector

1.1.9 别构酶调节酶活性的机理 1、对称或协同模型（symmetry or concerted model,也称齐变模型、MWC模型） 1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。 该模型的要点 : 正协同效应

1.1.9 别构酶调节酶活性的机理 2、序变模型（sequential model，也称KNF模型） 该模型的要点 : 1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。 该模型的要点 : 非底物调节的效应

1.2 酶活性的底物水平控制 Substrate level control – High levels of the product of a reaction inhibit the ability of the small amounts of substrate present to react e.g. the first step in glycolysis (糖酵解), catalyzed by hexokinase (己糖激酶) Inhibited by the product of its action, glucose-6-phosphate If glycolysis is blocked for any reason, glucose-6-phosphate accumulates.

1.3 酶活性的反馈控制 Feedback control The product of a series of reactions (like in an assembly line) inhibits the action of an earlier step in the process (usually the first step)

1.3 酶活性的反馈控制 反应终产物的积累最终导致整个通路的抑制。 e.g. 细菌通过5个步骤将L-threonine催化转变为L-isoleucine。 当终产物isoleucine水平上升后，它会抑制第一步酶苏氨酸脱氢酶的活性，从而对整个反应进行精细的调控。 the regulatory enzyme is specifically inhibited by the end product of the pathway whenever the concentration of the end product exceeds the cell’s requirements. When the regulatory enzyme reaction is slowed, all subsequent enzymes operate at reduced rates as their substrates are depleted. The rate of production of the pathway’s end product is thereby brought into balance with the cell’s needs.

1.4 别构调节的生理意义 ① 代谢终产物反馈抑制 (feedback inhibition) 反应途径中的酶，使代谢物不致生成过多。 乙酰CoA 乙酰CoA羧化酶 丙二酰CoA 长链脂酰CoA

– + 1.4 别构调节的生理意义 ② 别构调节使能量得以有效利用，不致浪费。 G-6-P 糖原磷酸化酶 抑制糖的氧化 糖原合酶 促进糖的储存

+ – 1.4 别构调节的生理意义 ③ 别构调节使不同的代谢途径相互协调。 柠檬酸 6-磷酸果糖激酶-1 抑制糖的氧化 乙酰辅酶A 羧化酶 促进脂酸的合成

2. 酶的共价修饰调节 Covalent modification activates some enzymes and inactivates others. Some modifications can be reversed. Modifying groups include phosphorylation（磷酸化）, adenylylation（腺苷酰化）, uridylylation（脲苷酰化）, methylation（甲基化）, and denosine diphosphate ribosyl groups （ADP－核糖基化）

2. 酶的共价修饰调节 磷酸化 腺苷酰化

2. 酶的共价修饰调节 ADP－核糖基化 甲基化

2.1 酶的磷酸化修饰 One of the most widespread modifications： phosphorylation / dephosphorylation of various amino acid side chains 在真核细胞中，大约有1/3至1/2的蛋白质发生磷酸化！

2.1 酶的磷酸化修饰 磷酸化过程是可逆的！ 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是由不同的酶所介导，因此这两个过程是独立被调控的。 Protein kinases --- 催化蛋白质的磷酸化过程； Protein phosphatases-----从蛋白质上移除磷酸基团。

2.1 酶的磷酸化修饰 特定的Kinase (蛋白激酶)可以识别保守的氨基酸序列，并对Ser, Thr, or Tyr 残基进行磷酸化； Phosphatases (磷酸酶) that hydrolyze specific P –Ser, P –Thr, and P –Tyr esters, releasing Pi 磷酸酶识别底物的保守性要比蛋白激酶差。

Ser(S), Thr (T), or Tyr (Y) residue that undergoes phosphorylation is in red X represents any amino acid B, any hydrophobic amino acid Sp, Tp, and Yp, already phosphorylated Ser, Thr, and Tyr residues.

2.2 磷酸化修饰调节酶活性 例：Glycogen phosphorylase (糖原磷酸化酶)的活性调节 Glycogen phosphorylase (Mr 94,500) of muscle and liver Phosphorylase a -----more active Phosphorylase b ----- less active

Regulation of glycogen phosphorylase activity by covalent modification.

2.3 肾上腺素对糖代谢的调节 血糖 肾上腺素+受体 肾上腺素-受体复合物 ATP AC G蛋白 cAMP 糖原合成酶 PKA 糖原合成 腺苷酸环化酶 cAMP 糖原合成酶 PKA 糖原合成 血糖 糖原分解 磷酸化酶b激酶 磷酸化酶b 磷酸化酶a 磷蛋白磷酸酶

2.4 几种重要的蛋白激酶 1、cAMP激活的PKA

钙调蛋白Calmodulin (CaM）： 2.4 几种重要的蛋白激酶 2、钙调蛋白激活的PKC 钙调蛋白Calmodulin (CaM）： Ca2＋ binding protein 4 Ca2＋+ CaM → Ca2＋- CaM ↓ CaM kinase↑

钙调蛋白

Inactive PKC Active PKC

2.4 几种重要的蛋白激酶 3、蛋白酪氨酸激酶 (Receptor Tyrosine Kinase) RTK：单次跨膜蛋白

Receptor Tyrosine Kinases (RTK)

生长因子受体的突变导致其持续活化

On-Off Switches The majority of signals are transient and the response should be proportionately transient too. If you switch the signal on, you need a way of switching it off again. For example, failure to switch off mitogenic signals is one way to induce a tumour. In many signalling systems the ‘on-off’ switch is operated by GTP-binding proteins and/or protein phosphorylation

3. 酶原的激活 酶原(zymogen)：酶的无活性的前体 酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶 的过程。 一些酶的活化需要发生蛋白质切割，如酶原（Zymogens） 酶原(zymogen)：酶的无活性的前体 酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶 的过程。 酶原激活的意义：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；如胰腺中合成的酶trypsin, chymotrypsin, elastase, and carboxypeptidase都是以酶原的形式存在。

一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽 3.1 酶原激活的机理 酶 原 分子构象发生改变 形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽 在特定条件下 irreversible

3.2 消化系统酶原激活的过程 肠激酶

---胰蛋白酶的活化 肠激酶

---胰凝乳蛋白酶的活化 Trypsin cleaves the bond between arginine 15 and isoleucine 16. Notice that the N-terminal peptide remains attached to the rest of the molecule due to the disulfide bond between residues 1 and 122.

---胰凝乳蛋白酶的活化

机体如何应对自发性的酶原激活？ 在胰腺中即使少量的胰蛋白酶活化也会导致疾病的发生，如 胰腺炎; 胰腺的胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor）可以结合并抑制 胰蛋白酶的活性； 1-antiproteinase抑制嗜中性粒细胞的弹性蛋白酶 (elastase)； 1-antiproteinase 蛋白的缺乏（可由抽烟引起）会导致肺功 能的损伤，如肺气肿。

缺失导致甲型血友病 3.3 凝血机制 Activation of zymogens is a key aspect to clotting of blood in vertebrates脊椎动物 V前加速素；VII前转变素；VIII抗血友病因子； IX克里斯马斯因子； X斯图亚特因子； XI促凝血酶原激酶前质；XIIHageman因子； XIII纤维稳定因子；PF3血小板第三因子

3.4 Isozyme（同工酶） 催化相同生化反应----相同的工作； 各组织或亚细胞组分中分布的不同以及它们之间底物的特异性和动力学的差别； 蛋白质分子结构、理化性质、免疫性能等方面有明显差异。

- + e.g. L-lactate dehydrogenase LDH (乳酸脱氢酶) LDH isozyme 有组织特异性, 相对含量的改变反映某脏器功能的状况 - + LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 心脏疾病：LDH1及LDH2上升，LDH3及LDH5下降 急性肝炎：LDH5明显升高，随病情好转恢复正常 慢性肝炎：LDH5有升高 肝硬变：LDH1、LDH3和LDH5均升高 原发性肝癌：LDH3、LDH4及LDH5上升，但LDH5 LDH4 转移性肝癌：LDH3、LDH4及LDH5上升，但LDH4 LDH5 ﹥

Asp AKI 同功酶对代谢的调节 e.g. E. Coli Thr, Met, Lys 的合成均以Asp为原料，第一个酶为天冬氨酸激酶（aspatate kinase, AK） AKIII AKII Asp-Pi lys Met Thr

4. 酶的应用 4.1 酶在疾病诊断方面的应用

4.2 酶法分析--酶偶联测定法 原理：酶促反应的底物或产物都没有在适宜波长的吸收光，把酶的测定与另一肯定有吸收光变化的酶促反应相连接。 举例： 苹果酸酶 （指示酶） GOT（待测） 天冬氨酸 草酰乙酸 苹果酸 α-酮戊二酸 谷氨酸 NADH+H+ NAD+ 340nm有吸收峰 340nm无吸收峰

4.2 酶与某些疾病发生的关系 1、酪氨酸酶缺陷---白化病 皮肤乳白色，毛发淡黄或银白色，瞳孔淡红，虹膜淡灰或淡红，半透明视网膜缺乏色素。 黑素合成的关键酶

4.2 酶与某些疾病发生的关系 2、苯丙氨酸羟化酶缺陷---苯丙酮酸尿症 智力低下，60%患儿有脑电图异常，头发细黄，皮肤色淡和虹膜淡黄色，惊厥，尿有“发霉”臭味或鼠尿味。

3、异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变---胶质瘤 4.2 酶与某些疾病发生的关系 3、异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变---胶质瘤 A a-酮戊二酸

4.3 利用酶的特性治疗疾病 TK(thymidine kinase)基因由病毒(Herpes Simplex Virus)编码，可以使无毒害的药物前体(pro-drug)变成对细胞有毒害的物质 （hu-tk） HSV-tk T TMP =T－P HSV-tK GCV GCV－P ganciclovir 人体细胞中 的磷酸激酶 GCV－P－P－P 可以与GTP竞争参加DNA合成

4.3 利用酶的特性治疗疾病 “Boy in Bubble” 25% SCID are due to mutations in ADA 真正意义上的基因治疗起始于1990年9月14日，美国的三位医生W. French Anderson, Michael Blaese, and Kenneth Culver对一名4岁的女孩DeSilva进行了基因治疗，她所患的病是SCID（Severe Combined Immunodeficiency ） （严重的综合免疫缺乏症） “Boy in Bubble” 25% SCID are due to mutations in ADA Adenosine deaminase (腺苷脱氨酶) ADA Deoxyadenosine inosine p-p-p 毒 机体免疫瘫痪 dATP T cell 毒 （50X ） B cell

Risks of Gene Therapy The Jesse Gelsinger Story Ornathine transcarbamylase (OTC, 鸟氨酸转氨甲酰酶 ) deficiency Urea cycle disorder: Usually fatal. X-linked (Mother carrier, son affected). 1/40,000. Sometimes mosaic (Jesse). Controlled with a low protein diet and 32 pills daily He still suffered from convulsions. Received Adenovirus expressing OTC in portal vein of liver. 1981 - 9/17/99 氨基酸讲解产生的大量氨分子迅速在脑细胞中与谷氨酸形成谷氨酰胺并积累在脑细胞中，使其森透压增高，导致了脑细胞水肿。 He died from multiple organ failure 4 days after starting the treatment. His death is believed to have been triggered by a severe immune response to the adenovirus carrier.

2003年10月，深圳赛百诺基因技术有限公司开发的一种针对头颈部肿瘤的p53基因治疗制品——“重组Ad-p53腺病毒注射液”，获得我国食品药品监督管理局颁发的新药许可证、生产批文和药品GMP证书。这是世界上首例商业化基因治疗制品。 2012年11月2日，欧洲药监机构首次批准了由荷兰一家小型生物技术公司UniQure生产的基因治疗药物Glybera，该药被用来治疗遗传性疾病脂蛋白脂酶缺乏症（LPLD）

4.3 酶工程（Enzyme engineering） 运用分子生物学的方法对酶进行改造，以获得高效催化能力的酶。 1. Site-directed mutagenesis （定点突变）– The DNA coding sequence for an enzyme is altered to change one or more amino acids in an enzyme when the mutated DNA is expressed in an organism

4.3 酶工程（Enzyme engineering） 2. Hybrid enzymes（杂交酶） - put together two different biomolecules to make a fusion molecule with new, useful properties 金黄色葡萄球菌核酸酶 通过碱基互补配对特异性切割底物

Useful Enzymes Used in Molecular Biology 4.4 酶在分子生物学上的应用 Useful Enzymes Used in Molecular Biology 1. 限制性内切酶 ﹡1970 2. Taq 聚合酶 ﹡1983 Kary mullis 3. RTase ﹡1970 Baltimore, Tamin 4. T4 DNA Ligase (T4连接酶) 5. T4 PNK (T4多核苷酸激酶) 6. CIP (碱性磷酸酶) 7. S1 核酸酶 8. TdT (末端脱氧核苷酸转移酶) Smith & Nathans

4.4.1 限制性内切核酸酶（Restriction Endonuclease） a.识别特定位点 b. 在DNA上make double strand cut 微生物具有R/M系统来保护自己，消灭外来DNA 对自己的DNA modify (修饰) 对foreign DNA Restricted (限制) 原始的免疫机制 修饰和限制是同一识别位点 ﹡ G AA TTC G AA TTC CTT AA G CTT AA G ﹡ 限制 修饰

4.4.2 Taq聚合酶 PCR原理 1. 变性(95°) 2. 退火(50~60°) 3. 延伸(72°) 反应混合物： 1. 模板(template) 2. 一对引物(primer) 3. Taq聚合酶(耐热) 4. 四种dNTP 5. 缓冲液(含Mg2＋)

4.4.3 Reverse Transcriptase (逆转录酶) Viral RNA（Retrovirus） Viral RNA Along with RTase infect into host cell cDNA replicate Translate one of viral genes: replicase gene DNA synthesis dsDNA integration replicase Part of host genome 如何检测某个基因在不同细胞内（如正常和肿瘤细胞）的表达水平？ 细胞 RNA cDNA PCR检测

-催化5’-磷酸基团和邻近的3’-OH基形成共价的磷酸二酯键 4.4.4 T4 DNA连接酶 -催化5’-磷酸基团和邻近的3’-OH基形成共价的磷酸二酯键 ---用于质粒的构建！ sticky OH p p OH OH p blunt p OH OH p 5’ 3’ OH OH 3’ 5’ Nick will be Sealed in host cell or Ligation ?

4.4.5 T4多核苷酸激酶 (T4 PNK , T4 polynucleotide kinase) Forward rxn: Phosphorylates 5’－hydroxyl terminus of DNA or RNA 5’OH OH 3’ T4PNK 5’P 3’OH 3’OH OH 5’ ATP 3’OH P5’ Exchange rxn: 5’P OH 3’ 3’OH P5’ （ATP）A－P－P－P （ADP）（A－P－P） T4 PNK 5’ P OH3’ 可以用于制作放射性探针 3’OH P 5’ ＋ ADP A－P－P ATP（A－P－P－P）

4.4.6 碱性磷酸酶 (CIP , Calf intestinal alkaline phosphatase) T4 PNK P OH CIP OH OH OH P OH OH CIP P OH OH OH ---可以用于单酶切情况下的质粒构建！

4.4.7 S1内切核酸酶 既是DNase又是RNase 作用方式是 endo（内切酶） 底物是ssDNA 或 RNA(ss) 条件: PH 4.5, Zn++ X174(ssDNA) M13 ss circular DNA Nick (缺口) S1 ?

S1内切核酸酶的用途 1、5’mapping (+1) -? ATG TAA mRNA AUG UAA M 蛋白质 AUG 电泳 确定RNA转录从第几个base开始的 (+1) -? ATG TAA mRNA AUG UAA M 蛋白质 AUG -125 +25 -100 电泳 ss D N A=125 nts起始位在-100 S1

S1内切核酸酶的用途 2、确定基因的内含子（Intron） I II Exon I intron Pre-mRNA mRNA Run gel 蛋白质 I II cDNA I II I II Run gel

4.4.8 TdT (末端脱氧核苷酸转移酶) For labeling purposes,OK For cloning, ? Why? ---Terminal deoxynucleotydyl transferase Catalize the polymeration of dXTP to 3’-termini of DNA molecules TdT AAAA Mg++,Mn++ AAAA dATP If T or C is added, Co++ is prefered TdT AAA CO++ AAA rATP For labeling purposes,OK For cloning, ? Why?

(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) 细胞凋亡的检测 其中一种方式叫TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) 末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记 Fluorescein-dUTP uuuu 正常 uuuuu uuu uuu uuu uuuuu 凋亡 uuu uu uu uu 荧光强度

分子生物学常用的工具酶 （1）限制性核酸内切酶：识别并特异切割DNA碱基序列；（2）TaqDNA聚合酶：DNA体外扩增(PCR)；（3）逆转录酶：催化合成cDNA；（4）T4DNA连接酶：应用于黏性或平末端DNA的连接；（5）碱性磷酸酶：防止载体自身连接、32P标记5′端；（6）T4多核苷酸激酶：5′端磷酸化、5′端标记放射性核素；（7）S1核酸酶：确定RNA起始转录位点（8）末端脱氧核苷酸转移酶：给载体或cDNA加上互补的同聚尾、加标记物。

课后复习： 问答题： 1、请举例说明酶原激活的过程和意义。 2、请列举分子生物学中常用的工具酶以及它们的用途。 名词解释： 1、别构调节；2、同促别构；3、异促别构；4、协同指数；5、K0.5；6、同功酶；7、酶的共价修饰；8、K型效应物；9、V型效应物；