生物转化与手性合成

主要内容 一、何谓ICE（Improved Chemical Entity） 二、 生物转化（Biotransformation） 三、手性（Chiral）合成与手性拆分 四、基因重组技术和蛋白质工程在手性化学中应用

一、何谓ICE（Improved Chemical Entity）改进的化学实体 Improved Chemical Entities (ICE™s), which are improved versions of existing, widely-sold drugs. The single enantiomeric form of a chiral drug is now considered as an improved chemical entity that may offer a better pharmacological profile and an increased therapeutic index with a more favorable adverse reaction profile. The prominent single isomer drugs, which are being marketed, include levofloxacin (S-ofloxacin), levalbuterol (R-albuterol), esomeprazole (S-omeprazole).

ICE战略提出 新药开发－先导化合物的产生和先导化合物的优化 手性药物迅速增长的市场需求，刺激了手性药物的研究与开法 （1996年手性药物制剂世界市场为730亿美元，预计到2000年将达到900亿美元 ） 通过揭示外消旋体的单一异构体或母体药物的活性代谢物的药理、毒理、代谢和临床效果之间的不同性能，从而发现能强化受体能力，缩短起效时间，限定活性延续时间，不良反应更小的新药。这些新化合物称为改进的化学实体(ICE)。 ICE战略已经取得了初步成效，并将取得更多的成绩

ICE战略的成绩 1 日本第一制药－抗菌药氧氟沙星－左旋异构体左氟沙星，1993年日本上市；2 山之内制药－抗高血压药物巴尼地平(barnidipine)，1992年在日本上市； 3 意大利Dompe制药对UCB公司开发的消旋羟丙哌嗪(dropropizine)进行了二次开发，其单一异构体左羟丙哌嗪(levodropropizine)于1988年在意大利上市，用于治疗咳嗽； 4 奥地利G.Broschek Gebro公司将Boots的外消旋非甾体抗炎药布洛芬进行了转化，1994年以(S)-(+)-布洛芬在奥地利上市； 5 英国Chiroscience除与意大利Menarini联合开发(S)-酮洛芬，1995年在西班牙上市外，还与Pharmacia公司合作对局麻药布比卡因(bupivacaine)左旋异构体左布比卡因(levobupivacaine)进行开发，对抗肿瘤药异环磷酰胺(ifosfamide) 右旋体右异环磷酰胺(dexifosfamide)进行开发。

美国马萨诸塞州Sepracor公司 1989年提出改进的化学实体战略，并将公司发展方向从开发分离技术转向对其他公司ICE化合物的开发和专利申请。该公司计划到2009年上市19个ICE药物 Sepracor的首次交易是在1993年，将其fexofenadine的美国应用专利许可给德国Hoechst Marion Roussel(HMR)公司，该药是曾经广泛使用而现已禁用的抗变态反应药特非那丁的活性代谢物，其主要优点是去除了其母体药物特非那丁的心脏毒性。按照协议，HMR公司获得了开发、生产和销售fexofenadine的权利，不仅将支付给Sepracor一笔费用，还要从2001年起提取销售额的4%～7%作为专利使用费给Sepracor

2009年上市19个ICE药物 ICE 药物 母体药物 适应症 Sepraco上市 1997母体销售额（M$) 去甲阿司咪唑 阿司咪唑 变态反应 150 2000 Desloratadine loratadine 变态反应 1700 2000 （S）－奥昔布宁 oxybutynin 小便失禁 130 2001 （R）－氟西汀 fluoxetine 抑郁症 2600 2001 (S )-西布曲明 sibutramine 肥胖症 2002 （R）－安菲他酮 amfebutamone 吸烟 50 2003 （S）－兰索拉唑 lansoprazole 胃疾病 700 2009 。。。。。。。

二、 生物转化（Biotransformation）

Biotransformation Key Advantages High selectivity Novel transformations become possible Effective under mild conditions: ambient tenperature & pressure, neutral pH ,aqueous and inert solvents, Ecologically sound Non-toxic biomass, energy efficient

Biotransformation Types Examples include virtually every type of chemical transformation: Oxidation/Reduction Hydrolysis Transesterification Hydroxylation Aldol, Diels-Alder… All with very high chemo-, regio- and enantioselectivity

Biotransformations Database Accelrys            A standalone database based on the book series, Biotransformations, published in the UK by the Royal Society of Chemistry and edited by Dr. David Hawkins. It covers the metabolism of drugs, agrochemicals, food additives and industrial & environmental chemicals in vertebrates.                                                                          Biotransformations Database Accelrys http://www.accelrys.com/

Abraxane (Paclitaxel) 美国制药（APP）和美国生命科学公司获得FDA批准上市Abraxane，治疗乳腺癌症。 药剂：非溶剂纳米白蛋白结合制剂，靶向药物 比紫杉醇（Taxol）作用时间更长，副作用更小

太平洋紫杉醇(Paclitaxel)

最广泛应用的生物转化－羟基化 微生物或酶体系的羟基化反应在甾体药物及其他药物的合成中获得广泛应用 主要酶系－细胞色素－P450酶系

放线菌中细胞色素P450酶系（Cytochrome P 450)

Microbial Conversion of ML-236B (Compactin) Na to Pravastatin

Microbial Conversion to Pravastatin Disturbance conversion rate Calculation of conversion rate Estimation of conversion rate after t ML t ML t Difference in set point and present value Fermentor Feed rate Set points ML-238B concentrations

Microbial Conversion to Pravastatin

Fermentative production of 17-ketosteroids Substrate (g l−1) Microorganism Main product Molar yield (%) Reference Lanosta-7,9(11)-dien-3-ol Mycobacterium sp. NRRL B-3805 4,8(14)-Androstadiene-3,17-dione 30 [55] (0.25) 3-Acetoxy-19- Moraxella sp. Estrone 15 [53] hydroxycholest-5-ene (0.5) Cholesterol (1.0) Mycobacterium sp. NRRL B-3805 Testosterone 51 [46] Ergosterol (0.3) Mycobacterium sp. NRRL B-3805 4-Androstene-3,17-dione 35 [56] Mycobacterium sp. NRRL B-3683 1,4-Androstadiene-3,17-dione 30 [56]
-Sitosterol (1.0) Mycobacterium sp. NRRL B-3805 4-Androstene-3,17-dione 25 [57] Mycobacterium sp. NRRL B-3683 1,4-Androstadiene-3,17-dione 20 [57] -Sitosterol (1.0) Mycobacterium sp. NRRL B-3805 4-Androstene-3,17-dione 90 [58] -Sitosterol (5.0) Mycobacterium sp. VKM Ac-1815D ET1 4-Androstene-3,17-dione 72 [59] Phytosterols (10) Mycobacterium MB 3683 4-Androstene-3,17-dione 90 [60] Phytosterols (30) Mycobacterium MB 3683 4-Androstene-3,17-dione 80 [60]

Combined chemical and microbial methods for steroid production: a route to 6-methyl steroids. Full lines indicate bioconversion whereas dashed lines indicate chemical transformation

甾体的羟化反应 Steroid Microorganism Reference hydroxylation reaction 7 Fusarium moniliforme, [82–84,89] Phycomyces blakesleeanus 11  Aspergillus ochraceus, Aspergillus [90–92] fumigatus, Rhizopus nigricans 15  Penicillium raistrickii [93] 16  Streptomyces roseochromogenes [94] 6  Bacillus thermoglucosidasius [95] 11  Cochliobolus lunatus [96]

  微生物转化法合成7，15－二羟基雄烯醇酮 尚 珂，胡海峰，朱宝泉 （上海医药工业研究院，上海 200040） 摘要：7，15－二羟基雄烯醇酮1是合成口服避孕药Yasmin活性成分屈螺酮的重要中间体，应用亚麻刺盘孢（Colletotrichum lini AS 3.4486）的羟化酶系统对去氢表雄酮底物进行生物转化，合成了7，15－二羟基雄烯醇酮，转化率60～70％。转化机理研究发现，亚麻刺盘孢将底物的7位羟基化合成7－羟基雄烯醇酮，再将其15位羟基化形成双羟基的产物。亚麻刺盘孢菌能够特异性、有序地完成对去氢表雄酮的两步羟化反应，与文献报道的结论一致，间接转化方法和转化机理属于首次报道。 收稿日期：2003－12－05 作者简介：尚 珂 （1980），女， 博士研究生，专业方向：微生物与生化药学 Tel：021-624798088×323，E-mail: shangke@hotmail.com 

7，15－二羟基雄烯醇酮 亚麻刺盘孢菌(Colletotrichum lini ）

坎利酮生物转化 Canrenone 15-hydroxylcanrenone 11-hydroxylcanrenone 11-hydroxyl-6,7-dihydrocanrenone 1 2 3 4

坎利酮生物转化 赭曲霉 Canrenone 15-Hydroxylcanrenone

三、 手性合成（Chiral synthesis）与手性拆分（Chiral resolution)

手性有关术语 e.e.=[E1-E2]/(E1＋E2） D/L或d/l:前者指分子的绝对构型，后者指右旋和左旋 立体异构体（stereoisomers):具有相同的连接方式而构型不同 非对映异构体（diastereoisomers):分子相互不为实物和镜像的立体异构体（D－赤藓糖和D－苏力糖） 对映体（enantiomers):分子互相为不可重合的实物和镜像的立体异构体 对映体过量（enantiomeric excess, e.e.): 光学活性(optical activity):左旋光与右旋光（旋光度） 外消旋（racemic):以外消旋体或两个对映体等量混合存在，（）表示 内消旋化合物：多个不对称中心分子，不能以对映体存在化合物，meso表示 e.e.=[E1-E2]/(E1＋E2）

手性药物（Chiral Drugs） FDA严格限制消旋药物的使用，新药应尽可能以单一手性异构体上市，消旋药物应严格研究其另一个对映体的药理与毒性 至1995年底市售底合成药为1329种，其中528种具有手性异构体，仅61种以单一手性药物上升 1994年手性药物底销售额比1993年增长27％

Chlonamphenicol（氯霉素） Propanolol（心得安，萘氧丙醇胺） 一些药物异构体的不同特性 药名 构型 生物效应 Thalidomide（沙利度胺） R 催眠镇静 S 强致畸作用 Chlonamphenicol（氯霉素） R，R 抗菌 S，S 无活性 Propanolol（心得安，萘氧丙醇胺） Β－阻滞剂 Sotalol（索他洛尔） D Ⅲ型抗心率失常 L Ethambutol（已胺丁醇） 致盲 S，R 抗结核 Tamoxifen（他莫昔芬） E 雌激素 Z 抗雌激素活性，治疗乳腺癌 Naproxen(萘普生） 肝脏毒性 抗炎 Ketoprofen（酮洛芬） 解热镇痛 镇痛抗炎 Amlodipine（氨氯地平） S（-） 抗心绞痛、高血压、充血性心力衰竭 R（+） 治疗和预防动脉粥样硬化

全球手性药物增长（百万美元） 所有药物 单一对映体药物 1999 2000 2005 止痛药 21500 23000 1173 1291 1395 抗生素／抗真菌 29300 31700 24918 26140 29747 抗病毒 17700 19100 6717 8820 12201 肿瘤 13700 15600 8891 10690 13605 心血管 42700 46600 24895 27650 34627 中枢神经 47700 53900 8439 9094 14700 皮肤病 17900 18400 16202 1272 1540 肠胃道 43900 47200 1970 4033 6590 血液病 16500 15400 7405 8879 11295 激素／内分泌 20000 22000 14510 15384 19790 眼病 7100 7400 1270 2265 2705 呼吸道 36500 40500 5696 6615 9620 疫苗 6500 7300 2503 3349 4320 其他 39000 41900 6248 7032 9730 总计 360000 390000 117763 132514 171865

对映体中间体和单一对映体药物的销售额（百万美元） BULK对映体药物 1999 2000 2005 抗炎止痛药 150 156 168 200 223 241 抗病毒 794 830 1643 983 1180 2054 肿瘤 892 1073 1297 1783 2146 2593 心血管 1133 2281 3269 1889 3802 5449 中枢神经 1038 1142 1821 1483 1632 2602 皮肤病 82 85 106 164 170 212 肠胃道 251 331 649 413 567 1082 眼药 238 284 401 340 405 573 呼吸道 576 656 914 1151 1511 2287 其他 140 356 315 426 891 总计 5294 7008 10624 8721 12062 17984

Chemical or enzymatic synthesis of single enantiomers The advantages of biocatalysis 1 Highly enantioselective and regioselective 2 Carried out at ambient temperature atmospheric pressure, thus avoiding the use of more extreme conditions which could cause problems with isomerization, racemization, epimerization,and rearrangement. 3 Immobilized and reused for many cycles economically efficient, and enzymes with modified activity.

微生物（或酶）转化法 微生物（或酶）转化法 专利号 主要内容 适用产品 EP689607 R-酮洛芬和S-酮洛芬的制备（酯水解酶催化水解） JP09056396 光学活性3-甲基-2-苯基丁胺的制取（微生物不对称水解） 布洛芬、酮洛芬 WO9640976 1，4-苯丙二恶烷-2-羧酸酯酶法对映体选择性水解 多沙唑嗪 JP02615780 光学活性羟基环丙烯酮化合物的合成（酶催化水解） 前列腺素类 WO9710355 光学活性酰胺的制备（腈生物或酶催化水解） 心血管系统药物 EP657544 JP8131189 3-苯基缩水甘油酸酯的制备（酶催化不对称水解） 地尔硫卓 JP7313189 光学活性－（羟基苯基）链烷酸地合成 拟交感神经药物 WO9721663 酶法DL－ －氨基酸拆分 L－ －氨基酸 EP693134 酮洛芬烷基酯微生物或酶催化裂解 EP675205 不对称醇类地酶法拆分 索他洛尔

微生物（或酶）转化合成药物手性中间体

微生物（或酶）转化合成药物手性中间体

不对称合成 反应类型 专利号 主要内容 适用产品 还原 US5380927 JP2536046 WO9529246 芳酮经选择性还原2－芳基链烷酸 羰基化合物不对称还原 还原制备（R）或（S）芳基乙醇胺 S－布洛芬 碳青霉烯类 沙丁醇胺 缩合 ES2065278 EP786459 对映体选择性合成左布诺洛尔 立体选择性合成光学活性杂双环醇 布诺洛尔 舍布林 烷基化 RU2072354 JP95057747 羟基吲哚立体性烷基化 烷基化合成3－（氨基甲基）－3－甲基吲哚 毒扁豆碱 氧化 WO9602535 立体选择性合成高光学活性亚砜类化合物 兰索拉唑，潘托拉唑等 氢氰化 US5484902 芳香族乙烯基化合物对映体选择性氢氰化反应 萘普生

异构体药物中间体的拆分方法 专利号 主要内容 拆分剂 适用产品 EP60384 光学活性阿替洛尔的分离 布朗斯台德酸 阿替洛尔 US5367091 D－（－）－乙酰基硫代－2－甲基丙酸制备 光学活性2－氨基丁醇 卡托普利 JP0212671 苏－羟基－甲氧基－苯硫基丙酸酯德拆分 酰化剂 地尔硫卓 WO9532178 沙丁胺醇光学活性异构体制备 双苯甲酰基酒石酸 沙丁胺醇 AS9712232 曲马朵的单对映体分离 酒石酸 曲马朵 ……….. …….. …….

四、基因重组技术和蛋白质工程在手性化学中应用

‘‘Biocatalyst engineering’’ Immobilization and protein engineering are long known for improving biocatalyst efficiency or stability of enzymes in aqueous media. Also, these methods have been used to improve biocatalyst performance in organic solvents. Protein engineering has become an increasingly important strategy for improving enzymes Rational design Directed evolution

谢谢大家！再见