实验二 有机磷农药对鱼脑乙酰胆碱酯酶的影响
一、实验目的 （1）了解有机磷农药的毒性机制 （2）掌握乙酰胆碱酯酶活性测定的原理和方法 二、实验原理 在神经冲动的传递中，乙酰胆碱是重要的化学因素——神经递质。
神经元可分为细胞体和突起(树突和轴突)
突触：一个神经元与其它神经元之间相接触，所形成的特殊结构。
神经元之间的突触传递必须以突触前膜释放化学物质作为中介，才能完成信息的传递，此化学物称为神经递质。 胆碱类：乙酰胆碱 （兴奋性递质） 胺类：多巴胺、5-羟色胺、组胺 氨基酸类：谷氨酸、门冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸 肽类：下丘脑调节肽、抗利尿激素、催产素、阿片肽、脑-肠肽、AⅡ、心房钠尿肽等 嘌呤类：腺苷、ATP 气体：NO、CO 脂类：PG类
多种神经毒物，如有机磷农药、氨基甲酸酯农药、毒扁豆碱，以及烟碱等，对胆碱酯酶都具有强烈的抑制作用，从而破坏神经冲动的正常传递。因此，可以通过测定鱼类脑胆碱酯酶活力的抑制程度，了解水体受有机磷农药和氨基甲酸酯农药污染的情况，特别是有机磷农药的污染程度。
胆碱酯酶活性测定原理： 胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸，中止反应后，未反应的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，后者与三氯化铁在酸性溶液中反应形成棕红色铁络合物。此棕红色强度与乙酰胆碱量成比例。原有的乙酰胆碱量与经胆碱酯酶水解后剩余的乙酰胆碱量之差为胆碱酯酶水解乙酰胆碱的量，以此来表示胆碱酯酶的活性。
三、实验步骤 （1） 取新鲜或-20℃冷冻鱼，从鱼头背面剖骨，细心取出完整的鱼脑，用滤纸轻轻吸去表面体液，称重，在冰浴下置玻璃匀浆器内，并加1mL磷酸缓冲液，匀浆，再用磷酸缓冲液稀释成每mL含2mg脑的组织液。
（2） 按下表加入试剂： 试 剂 试 管 样品管 对照管 空白管 标准管 乙酰胆碱（mL） 1 — 磷酸缓冲液（mL） 2 试 剂 试 管 样品管 对照管 空白管 标准管 乙酰胆碱（mL） 1 — 磷酸缓冲液（mL） 2 鱼脑组织液（mL）
（3）准确保温（如20、25或30℃）20min，取出试管，立即每管加碱性羟胺溶液4.0mL。充分摇匀，并在对照管加1mL鱼脑组织液。 （5）将每管试液用快速滤纸过滤，以除去蛋白质。 （6）显色后将所得滤液置2cm比色杯，在525nm波长下以空白管为对照测量光密度。
脑胆碱酯酶活力（μg分子/mg/h） = （对照管光密度—样品管光密度）/标准管光密度×4÷2×60/20 =（对照管光密度—样品管光密度）/标准管光密度×6 比酶活力（%）=样品酶活力/正常（对照）酶活力×100%
由于鱼脑胆碱酯酶的活力受到多种因素的影响，正常鱼的脑胆碱酯酶也可能有±30%的波动。因此，测定时一定要有足够的样品数，而且在实验室条件下酶活力下降15%，天然水体抑制30%，才能认为有机磷农药影响或污染。
实验报告 根据你的实验数据，分析其是否能反映鱼体受到有机磷农药的污染？ 思考题：用乙酰胆碱活性来指示有机磷农药污染有何优缺点？