第二章 愈伤组织的培养

主要内容 愈伤组织的诱导与分化 1 愈伤组织的继代培养 2 愈伤组织的形态发生 3 愈伤组织培养的应用 4

教学目的与要求 1.了解愈伤组织细胞分化的各时期的特点 2.掌握植物激素控制理论 3.掌握愈伤组织的形态发生 4.区别胚状体发生途径与器官发生途径形成植株 5.愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用

第一节 愈伤组织的诱导与分化

一、概念 1.愈伤组织培养 将母体植株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。 2.愈伤组织 在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。

3.分化 细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官。 4.脱分化 已分化好的细胞在人工诱导条件下，失去特有的结构功能，恢复分生能力的过程。 5.再分化 脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。

二、愈伤组织的诱导 1.概念：愈伤组织的诱导就是使已分化的植物细胞脱离原来的发育轨道，失去原有状态和功能，恢复到未分化的状态的过程。

2.形成愈伤组织的难易程度 （1）双子叶植物比单子叶植物和裸子植物诱导愈伤组织容易； （2）幼年细胞和组织比成年细胞和组织容易； （3）二倍体细胞比单倍体细胞容易。

3.诱导 （1）选取外植体 （2）外植体的处理 （3）培养基诱导

三、愈伤组织细胞的分化 从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：

1.诱导期 诱导期是细胞正在准备分裂的时期，是愈伤组织形成的起点。

（1）影响诱导期长短的因素 ①植物种类； ②外植体的生理状况； ③外部因素：光照、二氧化碳。 （2）植物生长调节剂对诱导期的影响 植物生长调节剂对诱导细胞开始分裂效果最好。通常依据实际情况，通过调节植物生长调节剂的种类和浓度来诱导细胞开始分裂。常用的有2,4-D、NAA、IAA和CTK。

（3）诱导期细胞内发生的变化 ①气体交换增加，如氧气的吸收增加； ②RNA含量增加（增加到300%）； ③蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%）； ④酶活性增强。

2.分裂期 指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞而形成愈伤组织的过程。

（1）细胞分裂期的主要表现 ①细胞的数目迅速增加； ②每个细胞平均鲜重下降； ③细胞体积小，内无液泡； ④细胞的核和核仁增至最大； ⑤细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变； ⑥随着细胞不断分裂和生长，细胞的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。

（2）分裂期的愈伤组织的共同特征 细胞分裂快； 结构疏松； 缺少有组织的结构； 颜色浅而透明； 维持其不分化的状态。

（3）优良愈伤组织的特征 ①高度的再分化能力； ②容易散碎； ③旺盛的自我增殖能力； ④经过长期继代保存而不丧失再分化能力。

3.分化期 分化期是指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形态和生理上的变化，形成一些不同形态和功能的细胞的时期。

分化期特点如下： （1）细胞分裂部位和方向发生改变； （2）分生组织瘤状结构和维管组织的形成； （3）细胞的体积相对稳定，不再减小。 （4）出现了各种类型的细胞。 （5）生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。

第二节 愈伤组织的继代培养

一、培养基和培养条件 1.培养基 （1）无机营养 氮、钾和磷——细胞过度生长，形成层组织减退； 铁——细胞分裂停止。 硼——细胞分裂停滞，细胞伸长。 锰或钼——影响细胞伸长。

（2）植物生长调节物质 一般使用的浓度为0.1～10mg／L。 使用植物生长调节剂时，要注意种类和浓度，特别是生长素和细胞分裂素的比值。 高 利于形成根 生长素/细胞分裂素 适中 产生愈伤组织。 低 利于芽的分化

（3）有机成分 培养基中加入糖、各类B族维生素、和甘氨酸等，可满足愈伤组织生长和分化的要求。 各种氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质，可促进器官分化。 酰胺类往往有促进器官形成的作用。

2.培养条件 （1）光照 在愈伤组织培养中，一般采用全暗、周期性光照、散射性光照三种方式。愈伤组织的诱导需弱光或不需光。继代培养一般需光。器官发生阶段，一般周期性光照比较好。 （2）温度 24～28℃

二、继代培养物的分化潜力 1.生理因素 在组织培养过程中，由于植物材料内部的一些变化，而导致继代培养物分化潜力发生变化。 2.遗传因素 在继代培养中通常出现染色体紊乱。

第三节 愈伤组织的形态发生

一、不定芽和根的发生 1.生长阶段 （1）外植体脱分化形成愈伤组织，这是外植体发生细胞分裂的结果； （2）愈伤组织中形成一些分生细胞，形成瘤状结构，这是细胞分化、分化组织出现和有限细胞分裂的共同结果。 （3）器官原基的形成，常由于在某些条件下，分生细胞团发生分化而形成不同的器官原基。

2.愈伤组织的器官发生方式 （1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根； （2）先形成芽，后在其茎的基部长根； （3）先长根，再从根的基部长芽； （4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。

不定芽方式 外植体 愈伤组织 芽 根 再生植株 脱分化 再分化 高生长素(1,2-D) 高(生长素/细胞分裂素) 低(生长素/细胞分裂素)

小麦的形态发生 愈伤组织 试管苗 再生苗 芽分化

二、体细胞胚的发生 指在组织培养中，由体细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程，形成的具有胚根、胚芽、胚轴的胚状结构（胚状体）。

1.胚状体的发育过程 原胚 球形胚 心形胚 鱼雷胚 子叶胚

第三节 愈伤组织的形态发生 2.由外植体经胚状体形成完整植株的过程 外植体 脱 分 化 愈伤组织 胚状体 再生植株

3.胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别 ①胚状体具有两极性，即有茎端和根端，而不定芽和根都是单向极性。 ②胚状体的维管组织与外植体的维管组织不相连，而不定芽和根与外植体维管组织相连。 ③胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形，而不定芽或根的维管组织无此现象。

3.胚状体方式比不定芽方式有更多的优点 （1）胚状体产生的数量比不定芽多； （2）胚状体可以制成人工种子，便于运输和保存； （3）胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。

4.影响胚状体形成的因素 （1）氮源 铵态氮对胚状体的发生更为有利，在多数情况下，同时使用铵态氮与硝态氮也可诱导很多胚状体的发生。 （2）植物生长调节物质 赤霉素、细胞分裂素等物质会抑制胚状体的发生。

第四节 愈伤组织培养的应用

1.加快了园艺植物新品种和良种繁育速度； 2.培育无病毒苗木； 3.获得倍性不同的植株； 4.克服远缘杂交困难； 5.利于种质资源长期保存和远距离运输； 6.提供育种中间材料； 7.诱发和离体筛选突变体； 8.制造人工种子。

本章小结： 1.愈伤组织培养含义。 2.愈伤组织形成分三个时期：诱导期、分裂期、分化期；每个时期细胞的特点。 3.分裂期愈伤组织的特征。 4.继代培养的含义。 5.愈伤组织器官发生的方式 。 6.胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别。

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