6. 蛋白质及氨基酸的测定 6.1 概述 6.2 凯氏定氮法 6.3氨基酸氮的测定

6.1 概述 （1）食品中的蛋白质含量及测定意义 （2）蛋白质系数 （3）蛋白质测定方法

食品中的蛋白质含量 牛肉 猪肉 兔肉 鸡肉 20 9.5 21 20 大豆 米 面粉 菠菜 苹果 40 8.5 10 2.4 0.4

蛋白质的测定意义 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。 　 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有 微量的s 、P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。

（2）蛋白质系数 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一 份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。 　　　不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。

(3) 蛋白质含量测定最常用的方法 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋白质用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍 被作为标准检验方法。 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定

学习重点与难点 掌握常量、微量凯氏定氮法的操作技能，及氨基酸态氮的检验方法和技术。 熟悉凯氏定氮装置的组件和安装、使用知识 学习重点与难点　 掌握常量、微量凯氏定氮法的操作技能，及氨基酸态氮的检验方法和技术。 熟悉凯氏定氮装置的组件和安装、使用知识 了解凯氏定氮法原理和方法，氨基酸和氨基酸态氮的测定原理；

6.2 凯氏定氮法 凯氏定氮法：常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法 6.2 凯氏定氮法 凯氏定氮法：常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法 微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。目前通用以硫酸铜作为常量、半微量、微量凯氏定氮法的催化剂。 在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题即分解试样所用的催化剂，得到改进。 　　　常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。

凯氏定氮法 6.2.1  原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 1、通过学习觊氏定氮法的原理，我们可知道操作分为哪几个大的步骤？ 2、加入硫酸钾、硫酸铜的作用是什么？

① 消化反应方程式如下： 2NH2(CH)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又具有氧化性,将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4

在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： ② 蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3＋ Na2SO4 ＋ 2H2O ③ 吸收与滴定 加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方程式如下： 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

(4)测定方法 ①.常量凯氏定氮法

改进后的消化装置

② 微量凯氏定氮法 ：样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后，完全转入100容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。 1. 样品消化 ②  微量凯氏定氮法 1.    样品消化 观察与思考： 1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？ 2、消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么？ 3、如何判断消化的终点？

1、为什么在蒸汽发生瓶中要加入指示剂甲基橙和硫酸？ 2.蒸馏 按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 在接受瓶中加入10ml 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。 思考： 1、为什么在蒸汽发生瓶中要加入指示剂甲基橙和硫酸？ 加入数粒玻璃珠的作用是什么？

3. 滴定 取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。

(5) 结果计算 式中W—蛋白质的质量分数，%； V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数； m—样品质量，g。

6.2.2 样品的分解条件 ：提高溶液的沸点 （1）K2SO4或Na2SO4 （2） 催化剂 ： 6.2.2 样品的分解条件 ：提高溶液的沸点 （1）K2SO4或Na2SO4 （2） 催化剂 ： CuSO4 、 氧化汞、汞、硒粉 都是良好的催化剂，但后三种有剧毒； （3）氧化剂 ： 过氧化氢

硫酸钾的作用 K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3 　　　一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高。 　　　但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O

硫酸铜的作用 ① 催化剂 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑ Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 ② 可以指示消化终点的到达 ③ 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

6.2.3 注意事项 （1） 所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性。 6.2.3 注意事项 （1） 所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性。 （2） 若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大量泡沫 应加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。 （3） 若样品消化液不易澄清透明，可加入300g/L2~3ml 过氧化氢后再加热。

（5） 若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。 （4）  硫酸铜起到催化作用，加速氧化分解。硫酸铜也是蒸馏时样品液碱化的指示剂，若所加碱量不足，分解液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量。 （5） 若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。 （6）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。一般消化至透明后继续30分钟即可.

（7）    蒸馏过程应注意接头处无松漏现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。 （8）  硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。 （9）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。

6.3氨基酸氮的测定 氨基酸态氮的测定 双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、测定方法、结果计算、说明 电位滴定法：原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算

6.3.1 双指示剂甲醛滴定法 (1) 原理 H H O H O +HCHO +NaOH R C C OH R C COOH R C C 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。 反应式（有三种不同的推论）如下： H H O H O +HCHO +NaOH R C C OH R C COOH R C C H3N C NH2 N CH2 R CH COOH R CH COOH R CH COONa 或 或 或 N (CH2OH)2 NH CH2OH N CH2 R CH COOH NH CHO

(2) 操作方法 用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量； 再用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量。 移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份，分别置于250ml锥形瓶中，各加50ml 蒸馏水，其中1份加入3滴中性红置试剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为 琥珀 色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录两次所消耗的碱液ml数。 用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量； 再用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量。

(3) 说明及注意事项 ① 此法适用于测定食品中的游离氨基酸。 ② 固体样品应先粉碎，准确称样后用水萃取，测定萃取液，液体试样可直接测定。萃取在50℃水浴中进行0.5h。 ③ 若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色，或用电位滴定法测定。 ④ 与本法类似的还有单指示剂(百里酚酞)甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和—COOH时的pH值为8.5～9.5，但分析结果稍偏低。

(4) 结果计算 氨基酸态氮 （%） 式中 c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L; V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL; V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL; m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014——氮的毫摩尔质量，g/m mol

6.3.2 电位滴定法 (1) 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。 (2) 仪器 酸度计（附磁力搅拦器）；

（3）按下式计算NaOH标准溶液的量浓度 G C= (V-V0) ⅹ 10-3ⅹ204.2 式中：C-----氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，mol/L： G------邻苯二甲酸氢钾的重量，g； V-----氢氧化钠溶液用量，mL V0----空白试验氢氧化钠溶液用量，mL； 204.2—邻苯二甲酸氢钾的分子量。

试验步骤 ① 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液（5mL酱油），置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）。 ② 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数。 ③ 同时取80mL水，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验。

（5）结果计算 ①数据记录 加甲醛前耗NaOH量/mL 加甲醛后耗NaOH量/mL NaOH标准液浓度/mol.L-1 样 品 滴 定 1 2 3 平均 空 白

氨基酸态氮% = ———————————— ×100 m × 20/100 ② 计算 （ V1 - V2 ）× c× 0.014 氨基酸态氮% = ———————————— ×100 m × 20/100 V1 --- 酱油稀释液在加入甲醛后滴定至pH8.2所用 NaOH标准溶液的体积，mL V2 --- 空白滴定在加入甲醛后滴定至pH8.2所用 NaOH标准溶液的体积，mL c --- NaOH标准溶液的浓度，mol/L m --- 吸取的酱油的质量，g（密度=1.15g/mL） 0.014 --- 氮的毫摩尔质量，g/mmol