第十四章 分子标记与作物育种

绪 分子标记辅助选择 (MAS) 的主要进展 1. 基因聚合 (gene pyramiding) 2 .基因转移 (gene transfer) 3. 数量性状的 MAS

第一节.分子标记的类型和作用原理 遗传标记（genetic marker）:指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。

遗传标记的类型 形态学标记（morphological marker） 细胞学标记(cytological marker) 生化标记(biochemical marker) 分子标记(molecular marker)：DNA分子遗传标记，或DNA标记。

形态标记 即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。 优点：形态标记简单直观、经济方便； 缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的;(2)且多态性较差，表现易受环境影响，(3)有一些标记与不良性状连锁。(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。

细胞学标记 即植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。 与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。

生化标记 主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是：指结构不同、功能相似的酶，也即具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个以上基因座位编码的酶的不同形式；而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。

与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。

一、分子标记标记的类型和特点

目前的分子标记类型 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括RFLP、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）等； 第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、序列特征化扩增区域SCAR等； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等。

分子标记的特点： （2）数量多 （3）多态性高 （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别 （1）直接以DNA的形式表现，表现稳定 （2）数量多 （3）多态性高 （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别 纯合体和杂合体。 （6）成本不太高

二、分子标记的原理和遗传特性 (一)RFLP标记 1.RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等，造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。

DNA提取 基 本 步 骤 用DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离，转移到滤膜上 Southern杂交 放射性自显影或酶学检测

2）特点 A 无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。 B RFLP标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。 C 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰 D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制 E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。

PCR-based markers PCR: polymerase chain reaction（多聚酶链式反应） amplification of tracts of DNA defined by border sequences that hybridize to selected DNA polymerase primers Requires: - target DNA - thermostable DNA polymerase (Taq) - oligonucleotide primer(s) (7-30nt) - dNTPs + Mg++

（二）RAPD标记 1.RAPD标记原理

RAPD标记的主要特点有： （1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； （4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。

（三）AFLP 1.原理

2.AFLP标记的主要特点有： （1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的； （2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高； （3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传； （4）分辩率高，结果可靠； （5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性带出现频繁、技术复杂、成本高等缺点。

（四）SSR 1.原理

SSR标记的主要特点有： （1）数量丰富，广泛分布于整个基因 （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。

几种主要的ＤＮＡ分子标记 英文缩写 英文名称 中文名称 RFLP Restriction fragment Iength polymorphism 限制性片段长度多态性 STS Sequence tagged site 序列标签位点 RAPD R andom amplified polymor- Phic DNA 随机扩增多态性DNA AFLP Amplified frangment length Polymorphism 扩增片断长度多态性 SSR Simple sequence repeat 简单序列重复 SNP Simple mucleotide polymor- phism 单核苷酸多态性

分子标记的遗传基础 标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择，有人称之为前景选择（foreground selection）。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确率。

利 用 MAS 的 遗 传 基 础 （以 RFLP 为 例） M—抗性标记 R—抗性基因 m—感病标记 r—感病基因 供体 受体 目标基因与DNA标记间的遗传距离位p M R m r 利 用 MAS 的 遗 传 基 础 （以 RFLP 为 例） 亲本中DNA标记的带型 M—抗性标记 R—抗性基因 m—感病标记 r—感病基因 M R m r F1杂种中DNA标记的带型 在F2分离群体中分子标记类型 即MM,Mm,mm MM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率 RR Rr rr (1-r)2 2r(1-r) r2

选择的正确率随重组率的增加而迅速下降。重组值越小，其错选率越低。 如果要求至少选到一株目标基因型的概率为P，则必须选择具有标记基因型MM的植株至少为： n＝log（1-P）/log（1-p） 式中p＝（1－r）2

对基因组中其他部分（即遗传背景）选择，称为背景选择（background selections）。背景选择的对象几乎包括了整个基因组，因此，这里牵涉到一个全基因组选择的问题，在分离群体中，由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生交换，因此每条染色体都可能是由双亲染色体重新组装的杂合体。

分子标记的优越性 1.克服性状表现型鉴定的困难 2.允许早期选择 3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用 4.允许同时选择多个性状 5.可进行性状非破坏性评价和选择 6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高育种效率

三.分子标记辅助选择应具备的主要条件 A：与目标基因紧密连锁的分子标记 B: 简便快捷的标记检测方法

How to use a genetic marker for marker-assisted selection Weaver Carrier Sire M1 M2 W + M1 M3 M2 M3 W + + + W=Weaver +=Normal

目标基因的标记筛选（gene tagging）是进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。用于MAS育种的分子标记须具备三个条件： 分子标记与目标基因紧密连锁 标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。 不同遗传背景选择有效。

第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术

一、遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记 遗传作图的原理 其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映DNA的实际长度。

构建遗传图谱的主要环节： 根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体。 对群体中不同植株的标记进行基因性分析。 借助计算机程序构建连锁群

构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。

永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等 用于分子标记的遗传作图可分为两类： 暂时性分离群体，包括F2群体、BC等 永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等

自花授粉作物作图群体的构建方法 P1×P2 F1 F1 F1×P1 F1×P1 F1×P1 F2 DHL B1:BC1 B2:BC2 F3 异花授粉作物作图群体的构建方法 杂合F1 ABCDEfG AbcdEfg 对B、D、G位点来说，相当于F2 对A、C、E位点来说，相当于测交 F位点不分离 × AbCDEfG aBCdefg

不同作物群体的特点 F2 BC1 DH RIL 群体 形成 性状研究对象 准确度 必要的群体规模 分离比例 F1自交后代 F1回交后代 个体 品系 准确度 低 高 必要的群体规模 大 中 分离比例 1:2:3或3:1 1:1 不同作物群体的特点

二、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记 http:linkage.rockefeller.edu/soft/list/html

三、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记

P: R/R r/r F1: R r  R r F2:

抗 感 杂 杂 杂 感 杂 抗 感 杂 抗 杂 杂 抗 感 分离群体 分子标记辅助选择 抗性鉴定 结果

四、数量性状基因的定位

四.影响分子标记辅助选择 (MAS) 的因素 大量理论和实践研究表明，影响 MAS 选择效率的因素非常复杂，其中标记与基因 (QTL) 之间的距离、目标性状的遗传率、群体大小和性质、选用分子标记数目以及标记与基因 (QTL) 的连锁相等是重要因子。

1 标记与连锁基因 (QTL) 间的连锁程度 前景选择的准确性主要取决于标记与目标基因的连锁强度，标记与基因连锁得愈紧密，依据标记进行选择的可靠性就愈高。 此外，重组值r也影响到由该标记位点等位基因分离产生遗传方差的大小r值越小，遗传方差越大，数量性状的选择效率越高。

2 性状的遗传率 性状的遗传率极大地影响MAS选择效率。遗传率较高的性状，根据表型就可较有把握地对其实施选择，此时分子标记提供信息量较少，MAS效率随性状遗传率增加而显著降低。利用MAS技术所选性状的遗传率应在中度(0.3～0.4)会更好。

3 群体大小和性质 群体大小是制约MAS选择效率的重要因素之一。一般情况下，MAS群体大小不应小于200个。选择效率随着群体增加而加大，特别是在低世代，群体连锁不平衡性越大，MAS效率就越高。由两个自交系杂交产生的F2群体，其连锁不平衡性往往最大，因而其MAS效率也较高。

4 选用分子标记数目和类型 理论上标记数越多，从中筛选出对目标性状有显著效应的标机会就越大，因而应有利于MAS。计算机模拟研究表明当每条染色体上标记数增加到6个以上时效率降低，最优距离为20cM。

沈新莲等用2个RAPD标记和1个SSR标记进行棉花纤维强度QTL辅助选择，比较显性标记和共显性标记之间纯合基因型和杂合基因型之间选择差异后，认为共显性 SSR标记(可有效地剔除杂合基因型)对以加性/隐性为主遗传的QTL进行MAS效果会更好。

5 显性标记的相位 对质量性状的选择，无论目标基因是否显隐性，均需选择到纯合植株，但显性标记无法鉴定纯合与否。Haley等研究菜豆普通花叶病毒隐性抗性基因，两RAPD标记一个相引(M1，1.9cM)，另一个相斥连锁(M2，7.1cM)时，用M1选择到纯合抗病、杂合体、纯合感病比例分别是26.3%、72.5%、1.2%，而用M2分别是81.8%、18.2%、0。

据此提出相斥相显性RAPD标记不论对显性还是隐性基因均可极大提高选择效率。由此可预见用相斥相的显性SCAR标记跟踪目标基因比相引相应更有效。

6 世代的影响 在早代(BC1)变异方差大，重组个体多，中选机率大，因此背景选择时间应在育种早期世代进行，随着世代的增加，背景选择效率会逐渐下降 。在早期世代，分子标记与 QTL 的连锁非平衡性较大，随着世代的增加，效应较大的 QTL 被固定下来，MAS 效率随之降低。

7 控制性状基因 (QTL) 数目 模拟研究发现随着 QTL 增加，MAS 效率降低。当目标性状由少数几个基因(1-3)控制时，用标记选择对发掘遗传潜力非常有效，然而当目标性状由多个基因控制时，由于需要选择世代较多，加剧了标记与 QTL 位点重组，降低了标记选择效果，在少数 QTL 可解释大部分变异的情况下，MAS效率更高。

8 控制数量性状QTL的划分、定位及其效应分布 QTL 的准确发现和对其效应无偏估计有助于MAS效率提高。QTL精确定位取决于分子连锁图谱的饱和度以及对QTL性状的准确度量，可利用永久分离群体通过反复试验精确定位QTL。

互作大小直接影响着MAS效率。一般在不同年份间不同时期不同地点均能检测到的QTL的效果较好。 基因型对QTL检测有较大影响，杂交早代植株基因型是杂合的。随着自交代数增加，许多位点趋于纯合，在早代选择的植株到高代表现会与原先表现不一致，应重新估价和筛选分子标记。同一性状在不同群体间甚至不同群体大小间的QTL不一致，这些因素均影响 QTLs检测并影响MAS的效率。

9 选择强度和QTLs的遗传方式和相位 在高选择强度下，常规选择更易丢失有利基因，MAS效率随着选择强度升高而增加。显性作用随着世代增加而降低，因此显性遗传QTLs的MAS效率高。当对多个QTL进行选择时，相引连锁比相斥连锁MAS效率高。在中等或较低选择强度下，目标基因(QTL)周围染色体区段由较远端标记控制更有效。

第二节 分子标记辅助选择的策略

一、作物MAS育种须具备的条件 分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。 具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用PCR技术。 筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。 具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。

二、MAS育种方法 （一）回交育种 （二）SLS-MAS （三）MAS聚合育种

目标基因的定位 与标记辅助回交 育种相结合程序图 受体亲本 × 供体亲本 (不含优质基因) (含优质基因) 中选BC3(含优质基因) F1 × 受体亲本 自 交 BC1 目标基因定位 标记辅助选择 新育成的优质品种 (受体亲本遗传本背景+优质基因) 中选BC1 × 受体亲本 (含优质基因) 目标基因的定位 与标记辅助回交 育种相结合程序图 BC2 标记辅助选择 中选BC1 × 受体亲本 (含优质基因) BC3 标记辅助选择

受体亲本 × 供体亲本A (无优质基因) (含优质基因A) 受体亲本 × 供体亲本B (无优质基因) (含优质基因B) F1(含优质基因A) × F1(含优质基因B) 受体亲本 × 供体亲本C (无优质基因) (含优质基因C) 复杂杂种(分离群体) 标 记 辅 助 基 因 聚 合 标记辅助选择 中选杂种个体 × F1 (含优质基因A和B) (含优质基因C) 复杂杂种(分离群体) 与 品 质 改 良 相 结 合 程 序 图 标记辅助选择 中选杂种个体 × 受体亲本 (含优质基因A、B和C) 回交1~2代，标记辅助选择 自交 新育成的优质品种 (受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C)

三、提高分子标记的筛选效率 （一）多重PCR方法 （二）用相斥相分子标记进行育种选择 （三）克服连锁累赘 （四）降低MAS育种的成本

MAS育种研究范围： 1.分子标记与资源评价（度量遗传多样性） 2.分子标记与亲本选配

品质性状分子标记体系 HMW—GS：2*、7、5、8、9、16、20 硬度：Pina/Pinb 淀粉：Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1 多酚氧化酶：2个 黄色素：1个

抗病分子标记体系 条锈：Yr5、Yr ZH84、Yr10、Yr24 白粉：Pm12、Pm16、Pm31

HMW-GS、LMW-GS的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE of 1BL/1RS translocation 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 B3b B B3d B3h B3j 1BL/1RS ω-Gliadin SDS-PAGE of 1BL/1RS translocation

PCR marker development for By8 By-null By16 By8 By18 By9 By15 By8* By9 By8 By20 By8* By20 M By8 527bp Dominant PCR marker system specific to glutenin By8

Molecular identification of Wx-B1 in Chinese wheat 1. CS 2. X( N4AT4B) 3. X(N4AT4D) 4. Beihuomai 5. Kanto107 6. Lu935031 7. Gamenya Molecular identification of Wx-B1 in Chinese wheat

PPO新标记品种检测 876 bp 685 bp

硬度 27 65 27 76 24 60 19 21 26 Friabilin蛋白电泳图谱，箭头示硬度相关谱带