环糊精增敏4-羟基香豆素衍生荧光法测定肉制品中痕量亚硝酸盐 实验十 环糊精增敏4-羟基香豆素衍生荧光法测定肉制品中痕量亚硝酸盐
1 实验目的 （1）学习衍生荧光法。 （2）学习环糊精增敏荧光法的原理
2 实验原理 亚硝酸盐是食品、环保、纺织及电镀等工业中重要的分析项目之一。亚硝酸盐可能与蛋白质分解产物－仲胺类物资结合，生成致癌物质亚硝胺，食品中亚硝酸盐含量必须控制在一个很低的水平。亚硝酸盐本省无荧光，不能用荧光法直接测定。衍生荧光法借助一定的化学反应，可以测定那些本身不发荧光的物质，亦可通过衍生反应，改变被测组分的化学组成和结构，借助于发光特性（波长、强度等）的改变，提高测量的选择性和灵敏度。
酸性介质中，亚硝酸根能与过量4-羟基香豆素迅速反应形成低荧光性的亚硝基衍生物一3-亚硝基4-羟基香豆素，该产物经 Na2S2O3还原为 3-氨基4-羟基香豆素后，在碱性介质中能发射较强的荧光，若有适量β-环糊精(β-CD）存在，由于β-CD对发光体的包络作用，荧光强度大大增强，可显著提高测量的灵敏度。体系的λ/ λ=332urn／457urn，亚硝酸盐（以 NaNO2计）在 1～1200ng／25mL浓度范围内与荧光强度呈良好线性关系，检出限40pg／mL。本法灵敏度高，选择性好，可用于水样、肉制品中痕量亚硝酸盐的测定。
3 仪器与试剂 仪器：日立 M850荧光分光光度计（或 PE LS-50B型发光光度计）：基本操作参见附录 参数设置如下： 带通（Bandpas）：EX＝EM＝3．0nm 增益（PM gain）：Normal； 2 5mL定量试管（容量瓶） 分度吸量管。
试剂 4-羟基香豆素溶液：用1：1（体积比）的乙腈-2mol/L盐酸混合液配制成0.04％溶液； NaNO2标准溶液：NaNO2（A· R级）于110○红外灯下干燥4h后，用水配制1mg/mL标准溶液，在冰箱中保存（每周新配一次），用时用水准确稀释到1μg/mL； β-CD溶液：用市售品经水重结晶的β-CD配制成0.01 mol/L水溶液； Na2S2O3（A· R级）8％水溶液； 1.5mol/LNaOH水溶液； pH 9.6NH4Cl-NH3·H2O缓冲溶液； KAl（SO4）2饱和水溶液。
5 注意事项 （1）NaNO2水溶液不稳定，其标准溶液要新配制，并注意保存。 （2）4-羟基香豆素的亚硝基化反应要在冰水浴中进行 （3）检出限测定中的空白实验，按规定应做更多的次数。实验时应特别注意容器的清洗。
6 数据处理和结果表达 （1）选择 NaNO2含量相同的试样（如含0.05mL 1µg／mL NaNO2标准液）实验比较有、无β－CD时的荧光激发和发射光谱图，说明β－CD的增敏作用。 （2）由实验数据拟合工作曲线方程，并按照国际纯粹及应用化学联合会（IUPAC）规 定，以试剂空白荧光值的3倍标准偏差除以工作曲线斜率，计算本法测定 NaNO2的检出限。 （3）计算加标回收率（％）和肉制品中NaNO2含量，并与国家食品添加剂使用卫生标准GB2760一81进行比较，判定是否合格。
7 思考题 （1）为什么4 -羟基香豆素的亚硝基化反应要在冰水浴中进行？ （2）从发光物质激发态的辐射和非辐射失活的竞争，考虑环糊精对发光体系的增敏作用和条件。 （3）为什么可用试剂空白荧光的三倍标准差与工作曲线斜率的比值表示方法的检出限？