河北医科大学第四医院暨河北省肿瘤医院肿瘤研究所 WNT抑制因子-1基因启动子区甲基化状态 与贲门腺癌发生的关系 河北医科大学第四医院暨河北省肿瘤医院肿瘤研究所 郭艳丽

贲门腺癌(Gastric cardic adnocar- cinoma,GCA)是常见的上消化道恶 性肿瘤，过去在肿瘤登记中经常被 当作食管癌或胃癌，近些年由于病 理诊断及内镜技术的进步已将其独 立了出来。 中国贲门癌的界定标准 ( 1991年 ) 瘤体发生在齿状线下约 2.0 CM 流行病学调查表明，在上消化道 肿瘤高发区，食管癌及远端胃癌 的发病呈下降趋势，而贲门癌的 发病则不断上升。因此，对贲门 癌的病因学研究不容忽视。

？ 并非所有暴露 个体均患病 亚硝胺类化合物 吸烟、饮酒 营养缺乏 霉菌感染 环境与遗传因素共同作用 抑癌基因的失活 和原癌基因的激 活的基因改变积 累的遗传学和表 遗传学的疾病 癌症 贲门癌 ？ 甲基化 抑癌基因 的失活 遗传因素 和表观遗 传因素

Wif-1基因作为候选抑癌基因是Wnt/β-catenin信号传导通路的拮抗基因之一，研究发现该通路的异常激活与多种肿瘤的发生密切相关。 拮抗基因的表达下调可减弱对通路的抑制作用，使通路活化，促进下游多种靶基因过度表达，进而参与肿瘤的发生。 VEGF-C/VEGF-D是这条通路的下游靶基因，两者高度同源，可促进肿瘤组织血管及淋巴管的生成。

经典Wnt 信号转导通路

目的 检测贲门腺癌中Wnt抑制因子-1（Wif-1）基因启动子区甲基化状态及通路中心因子β-catenin，下游靶基因VEGF-C、VEGF -D蛋白表达情况，探讨其与贲门癌发生的关系及可能的作用机制。

材料与方法 河北医科大学第四医院2004-2006年的 贲门癌手术患者，共94例，其中男性78 例，女性16例，年龄范围37-79岁，平均 年龄53.8岁。每例患者均取贲门癌原发灶 及相应残端正常粘膜组织。 研究对象 甲基化特异性PCR（MSP） 实验方法 RT-PCR检测 免疫组化SP法

Table 1 primer sequence and PCR conditions Sense primer (5'-3') Antisense primer (5'-3') Annealing temperatures Product size (bp) MSP primers Methylated CGTTTTATTGGGCGTATCGT ACTAACGCGAACGAAATACGA 55.2℃ 145 Unmethylated GGGTGTTTTATTGGGTGTATTGT AAAAAAACTAACACAAACAAAATACAAAC 60.5 ℃ 154 RT-PCR primers Wif-1 TCTGTTCAAAAGCCTGTCTGC CCTTTTATTGCAGTGTCTTCCA 57.4 ℃ 111 GAPDH GGGAAACTGTGGCGTGAT GTGGTCGTTGAGGGCAAT 354

结果一 贲门腺癌中Wif-1基因启动子区甲基化状态分析 94例贲门腺癌及94例相应正常粘膜组织均成功进行了MSP检测，结果共有三种情况： (1)完全甲基化； (2)不完全甲基化； (3)未发生甲基化。

MA: Maker; N: normal tissue; T: tumor tissue; M: Methylated genes; U: Unmethylated genes. Cases 1: tumor-specific methylation; Case 2: the tumor is hemi-methylated, whereas the corresponding normal tissue is unmethylated; Case3: both tumor and corresponding normal tissue are hemi-methylated; Case 4: both tumor and corresponding normal tissue are unmethylated. Methylation analysis of Wif-1 gene in tumor tissue (T) and corresponding normal tissue (N).

将不完全甲基化状态计入甲基化进行统计， 则贲门癌组织的甲基化率为61 将不完全甲基化状态计入甲基化进行统计， 则贲门癌组织的甲基化率为61.7%（58/94），而相应正常粘膜仅有32例检测到甲基化，占总例数的34.0%，癌组织中Wif-1基因的甲基化率显著高于正常黏膜组织（P<0.05）。 Wif-1基因高甲基化可能与贲门癌的发生有关 提示

Analyses of Wif-1 gene methylation status in GCA Group N Wif-1 χ2 P M U Histological grade well differentiation 40 24 16 0.085 0.770 Poor differentiation 54 34 20 Lymph node metastasis Positive 50 10 15.135 0.000 Negative 44 18 26 TNM stage Ⅰ+ Ⅱ 38 2.221 0.136 Ⅲ + Ⅳ 56 M: methylated ; U: unmethylated

结果二 Wif-1基因mRNA的表达 提示 该基因转录水平的下调可能参与了贲门癌的发生 The mRNA expression of Wif-1 gene N Wif-1mRNA P + － Normal tissues 94 81 13 0.000 GCA 10 84 提示 该基因转录水平的下调可能参与了贲门癌的发生

typical RT-PCR results of the Wif-1 gene in 5 matched pairs (case1-case5) of tumor tissue (T) and normal tissue (N). GAPDH is shown as a control. The mRNA expression of Wif-1 gene

Wif-1 gene mRNA expression between MSP-positive and MSP-negative groups in GCA Wif-1 methylation status N Wif-1 mRNA χ2 P + － M 58 2 56 8.172 0.004 U 36 8 28 Wif-1基因启动子区的甲基化和该基因在 mRNA水平上的表达缺失有明显的相关性 提示 Wif-1基因启动子区的甲基化可能是引起 该基因表达沉默的机制之一

结果三 β-catenin蛋白表达情况 贲门癌组织中β-catenin蛋白的 异质表达率（90.4%），明显 免疫组化染色镜下观察为胞浆/胞膜着色。 正常生理状态下，β-catenin的表达定位于细胞膜；当Wnt信号通路异常激活时，其表达定位于细胞浆。 将β-catenin的胞膜表达定义为正常表达，而将胞浆的异常积聚定义为异质表达。 β-catenin蛋白表达情况 贲门癌组织中β-catenin蛋白的 异质表达率（90.4%），明显 高于相应正常粘膜组织（38.3%） （P<0.05）。 该通路在贲门癌中可能处于激活状态

The expression of β-catenin in normal tissues The expression of β-catenin in GCA

Wif-1基因启动子区的甲基化和β-catenin 蛋白的异质表达有明显的相关性 β-catenin expression between MSP-positive and MSP-negative groups in GCA Wif-1 methylation status N β-catenin expression χ2 P Membrane cytoplasm M 58 1 57 11.096 0.001 U 36 8 28 Wif-1基因启动子区的甲基化和β-catenin 蛋白的异质表达有明显的相关性 该基因的高甲基化可能是引起ß-catenin 蛋白 异质表达的机制之一，并可能与Wnt/β-catenin 信号通路的活化有关 提示

结果四 组化染色镜下观察 均为胞浆着色，以 胞浆出现棕黄色颗 粒定义为阳性表达。 VEGF-C、VEGF-D的表达情况 贲门癌组织中VEGF-C、VEGF-D蛋白阳性表达率 分别为63.8%（60/94）和76.6%（72/94），明显 高于相应正常粘膜组织（P<0.05）。

Positive expression of VEGF-C in poorly differentiated GCA Positive expression of VEGF-D in well differentiated GCA

VEGF-C、VEGF-D蛋白的高表达与 Table 5 VEGF-C、VEGF-D expression between MSP-positive and MSP-negative groups in GCA Wif-1 methylation status N VEGF-C χ2 P VEGF-D + － M 58 43 15 6.970 0.008 49 9 5.255 0.022 U 36 17 19 23 13 VEGF-C、VEGF-D蛋白的高表达与 Wif-1基因的甲基化有明显的相关性

小结 贲门腺癌中Wif-1基因呈高甲基化状态，并可能通过β-catenin 蛋白的异常积聚引起Wnt/β-catenin信号传导通路的活化，进而促进了下游靶基因VEGF-C、VEGF-D的过表达，而与贲门癌的发生密切相关。

研究发现除在肿瘤组织中出现了Wif-1基因的高甲基化现象外，在部分正常粘膜组织标本中也出现了该基因的甲基化，但均表现为不完全甲基化。 现象一 研究发现除在肿瘤组织中出现了Wif-1基因的高甲基化现象外，在部分正常粘膜组织标本中也出现了该基因的甲基化，但均表现为不完全甲基化。 究其原因，一是可能由于正常粘膜组织中混有微量的肿瘤组织，或是由于个体差异，部分贲门癌患者的正常粘膜中本身就存在该基因的甲基化现象。尽管如此，肿瘤组织的甲基化现象仍占有主导地位，具有特异性。

Wif-1基因的甲基化频率与肿瘤分期及临床病理参数之间的关系与以往研究有一定的分歧 现象二 Wif-1基因的甲基化频率与肿瘤分期及临床病理参数之间的关系与以往研究有一定的分歧 肿瘤类型的不同和所选人群的差异 1 样本量和各个分期的构成比差异 2 地区和遗传背景的差异 3

谢谢