电 泳 Electrophoresis

一、定义 电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。 电泳分析技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。

二、电泳分析技术发展概况 1809年 发现电泳现象 1937年 Tiselius 自由界面电泳 1948年 Wieland 滤纸电泳 1809年 发现电泳现象 1937年 Tiselius 自由界面电泳 1948年 Wieland 滤纸电泳 1980’s 毛细管电泳 (capiliary electrophoresis) 毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。实际上包含色谱、电泳及其交叉内容，其分离机制是靠色谱与电场两种作用，依据样品组分的分配系数及电泳的迁移率差别而分离。

三、电泳分析技术的分类 1.根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳 2.根据电泳电压的高低 常压电泳 0～500 V

3.根据电泳中是否使用支持物 自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳—使用支持物 (1) 按支持物的物理性状不同，可分为 ①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维 ②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 ④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳

(2)按支持物的装置形式不同，可分为 ① 平板式电泳 ② 垂直板式电泳 ③ 垂直柱式电泳

4.根据电泳系统pH是否连续 连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳 不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH，如 PAGE、IFE 优点是在不同 pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。

电泳技术的特点: 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析; 样品用量极少; 设备简单; 可在常温进行; 操作简便省时; 分辨率高.

电泳技术应用 基础理论研究; 临床诊断; 工业制造. 双向凝胶电泳和质谱技术的建立和联用,提供了蛋白质组研究所需的技术体系,使得蛋白质组的研究成为可能.

四、电泳的基本原理 一个质点，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。

以蛋白质分子为例: F= EQ （Q：有效电荷，E：电位梯度） F’=6rv （F’：摩擦阻力，v：在介质粘度η中半径为r的颗粒的移动速度） F=F’ EQ=6rv E Q v= ———— 6r

迁移率（Mobility)——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 V Q M=-----------= ----------- E 6r

五、影响电泳速度的因素 1.电场强度（E） E↑→电流↑→热效应→支持介质上的水分蒸发→样品的热变性

溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。 缓冲液的浓度可用摩尔或离子强度表示.离子强度低,电泳速度快,分离区带不易清晰,如果过低,缓冲液的缓冲量小,难以维持pH值的恒定;离子强度高,电泳速度慢,但区带分离清晰,如果过高,除了使得电泳速度过慢,还会因为离子强度增加使电泳时的电流变大,增加热量的产生,引起温度改变,对电泳不利。一般0.02~0.2M之间。

3.缓冲液的pH pH值决定了化合物解离的程度，也决定了质点所带的净电荷。

4.电渗（electro-osmosis）——指在电场作用下液体相对于固体支持物的相对移动。 --------------- +++++++++ ————— ————— +++++++++（液）--------------- 负极 ← →正极 许多固体表面都带有多余（额外）的负电荷，溶液中的正离子吸附至固体表面形成双电子层，当在液体两端施加了电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这一现象称为电渗，电渗中液体的整体流动叫电渗流。

5.分子筛 在凝胶电泳中，分离蛋白质等物质除了利用所带电荷的差异的效应外，还利用了其分子量的不同及形状不同。

5.温度 电泳时电流通过支持介质会产生热量，按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度的平方、导体的电阻和通电的时间成正比（Q=I2Rt） 产热可促使支持介质上溶剂的蒸发，而影响缓冲溶液的离子强度。温度升高时，介质黏度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移增加。温度每升高1度，迁移率约增加2.4%。若温度过高可导致分离样品变性而使电泳失败。

醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME

一、醋酸纤维素       是纤维素醋酸酯，由纤维素的羟基进行乙酰化后制得，将它溶于有机溶剂涂抹成均匀的薄膜，待有机溶剂挥发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜。 厚度：0.15mm

二、特点 1.吸附作用小 2.电渗作用小 3. 需加样量少 4. 吸水性差

血清蛋白质各组分的相对分子重量及等电点 蛋白组分 相对分子重量 等电点 Alb 1 2   66248 130000 200000 1300000 1500000 4.86 5.02 5.12 6.8～7.3

丽春红S染色扫描法结果 蛋白组分 g/L 占蛋白百分数（%） Alb 35～52 57～68 1 1.0～4.0 1.0～5.7 2 4.0～8.0 4.9～11.2  5.0～10.0 7.0～13  6.0～13.0 9.8～18.2

氨基黑10B染色洗脱法结果 蛋白组分 平均值 参考范围 Alb 1 2   65.59 3.12 6.16 9.09 17.40 57.45～71.73 1.76～4.48 4.04～8.28 6.79～11.39 11.85～22.97

几种疾病的蛋白电泳变化 病名 Alb 1 2   肾病 肝硬化 原发性肝癌 多发性骨髓瘤 慢性炎症 无丙种球蛋白症 双白蛋白血症 ↓ ↑ AFP   -桥 ↑↑ ↓↓

三、影响醋纤电泳结果的因素 1. 电泳图谱不齐 ① 点样时血清点加不均匀 ② 薄膜局部干燥 ③ 电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 1.  电泳图谱不齐 ① 点样时血清点加不均匀 ② 薄膜局部干燥 ③ 电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④ 缓冲液变质 ⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行

2. 电泳图谱分离不清 ① 标本加量过多 ② 电流过低 ③ 薄膜结构过分致密，透水性差 ④ 薄膜表面干燥

3.  电泳速度慢 ①电流过低 ②供给薄膜的液量不足 ③电泳时温度过低 ④缓冲液离子强度过高 ⑤薄膜中杂质多

4.  白蛋白区带中间部分不着色，染色不足 可能为染料使用过久或加血清过多 5.γ球蛋白向反方向移动 主要因为电渗现象 可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

[原理] CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。 将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等点电不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。 电泳后,CAM经染色和漂洗，可清晰呈现5条区带。再经脱色，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。

加样 β α1 + — 白蛋白 γ α2

[器材和试剂] 1.器材 （1）醋酸纤维薄膜（8×2mm） （2）点样器 （3） 染色皿，漂洗器，镊子 （4） 722型分光光度计 （5）电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽 2.试剂 （1）巴比妥缓冲液（pH8.6 I=0.06） （2）氨基黑10B染色液 （3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O （4）洗脱液：0.4mol/L NaOH

[操作] 1.将电泳槽置于水平平台上。将缓冲液注入电泳槽中两边的电极槽缓冲液的高度要在同一点平面上。 2.在醋纤膜一端欲点样处作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，湿润速度按膜吸收缓冲液的快慢而定，应让其自然浸润。 3．将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液。 4．用加样器蘸取血清（约5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器。

5．电泳 （1）加样后，将薄膜条架于支架两端，无光泽朝下（点样面），点样侧置于阴极端，膜两侧分别塔上纱布，纱布一端垂入缓冲液中。薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳。 （2）正确连接电泳槽与整流器对应的正负极。开启电源通电。电压10~15V/cm膜总宽。电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。

6.染色 电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5~10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。 7．漂洗 从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂尽为止。此时清晰可见5条色带，待干。

8.定量 （1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/l NaOH 4ml,于37℃水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。 （2）计算 吸光度总和（T） =A+α1+α2+β+γ（吸光度）  

  血清蛋白组分的相对百分数： A%=A/T×100% α1%=α1/T×100% α2%=α2/T×100% β%=β/T×100% γ%=γ/T×100%

小 结 1.掌握电泳的基本原理及影响电泳迁移率的因素 2.掌握CAME的原理及操作方法

思 考 题 名词解释 1.迁移率 2.电渗 3.电泳 问答题 1.血清蛋白电泳的基本原理是什么？ 2.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 思 考 题 名词解释 1.迁移率 2.电渗 3.电泳 问答题 1.血清蛋白电泳的基本原理是什么？ 2.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 3.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？