专题3 植物的组织培养技术 课题1 菊花的组织培养
一、实验条件 1、药品
2、仪器 高压灭菌锅 分析天平 无菌工作台 光照培养箱
二、实验操作及注意事项 1、配制母液 （一）制备MS固体培养基 按照MS培养基成分表, 分别配制培养基的母液。 (1) 大量元素母液(10倍液) 分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的（60-80℃）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。
(2)微量元素母液(100倍液) 分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定溶到1000ml。 (3)铁盐母液（100倍液） 称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O，溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。
(4)有机物质母液(100倍数) 分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。 除上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生物素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。
(5)生长素 如2,4-D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml 95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。 (6)细胞分裂素 如激动素(Kt)、6-苄基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/ml HCL或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。
注意:配制培养基时，一定要注意调节pH。 2、培养基配制配制与分装 (1)取1000ml烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml,有机物质100倍母液10ml。此外,根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长素,细胞分裂素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后用1mol/L 的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8,最后加入琼脂粉6.5g,如用琼脂条,则要加8g。 注意:配制培养基时，一定要注意调节pH。
将配制好的培养基分装到培养用三角瓶中，每只100ml三角瓶约装40ml培养基。 分装时要避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染。
3、灭菌 1、把装好的培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖。 2、设置灭菌参数为121℃，20min，开始灭菌。 无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键．
（二）外植体消毒 1、取菊花生长旺盛的嫩枝(外植体不能太小，否则会影响愈伤组织的形成)。 2、流水冲洗后加少许洗衣粉,刷洗,流水冲20分钟。 3、70﹪酒精中摇动2~3次,持续6~7秒,无菌水冲洗; 4、0.1﹪的氯化汞溶液中1~2分钟，清洗，漂净消毒液. 注意：对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。
（三）接种 2、放入培养瓶和灭菌后的接种用具(镊子、解剖刀、接种针)，把镊子、解剖刀、接种针插入内盛70%酒精的广口瓶中。 1、先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽。 2、放入培养瓶和灭菌后的接种用具(镊子、解剖刀、接种针)，把镊子、解剖刀、接种针插入内盛70%酒精的广口瓶中。
注意事项 3、小心打开三角瓶，把花茎插入培养基。 4、用记号笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号、 接种日期。 全部接种操作都是在无菌条件下进行的，所以要特别认真仔细，以防杂菌污染。
（四）培养 接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒．温度控制在１８～２２℃，并且每日照光１２小时 .观察记录生长情况，并照相存档。
（五）移栽
三、结果分析与评价 （一）对接种操作中污染情况的分析 接种3～4 d后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。请学生适时统计污染率，分析接种操作是否符合无菌要求。
（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化 观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和时间。 （三）是否进行了统计、对照与记录 做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要求做好实验记录，实验小组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培养基，然后做不同配方的比较。
（四）生根苗的移栽是否合格 生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12 h。掀开塑料薄膜后24 h才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。学生可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。
四、课题延伸 探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响．
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