第5章 基因的体外重组 Plasmids are widely used as cloning vehicles.

basic process of DNA recombination in vitro 体外DNA重组的基本步骤 * basic process of DNA recombination in vitro 体外DNA重组的基本步骤 1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 2.重组载体的制备：将目的基因的DNA片断连接到能自我复制并带有选择性标记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上 （DNA重组过程，需要内切酶、连接酶等工具酶的参与） 3.重组载体的转化：将重组载体转入适当的受体细胞中。 4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因） 5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物

* Generalized overview of cloning strategies, with favoured routes shown by arrows. P103(图6-1) 3 3

contents 1 质粒载体 2 噬菌体载体 3 柯斯质粒载体 4 人工染色体载体 5 Specialist-purpose vectors 6 DNA的连接

* 1质粒载体 1.1质粒的一般生物学特性 What are plasmids? 定义：染色体之外的遗传物质,可自主复制并稳定遗传 Plasmids are extrachromosoma genetic elements that are not essential for bacteria to survive but often confer advantageous traits (such as antibiotic resistance) on the host cell. 定义：染色体之外的遗传物质,可自主复制并稳定遗传 来源：常见于原核细菌和真菌中,某些蓝藻、真菌和绿藻中也有发现 在形形色色的生命形态中，质粒是一类特别引人瞩目的亚细胞有机体。其结构较病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也没有细胞外的生命周期，只能够在寄主细胞内独立增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。在自然界中，无论是真核生物还是原核生物，无论是革兰氏阴性菌还是阳性菌，甚至是真菌的线粒体，都已经发现有质粒分子的存在。 质粒并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。 分子量小，编码的蛋白质一般也不大。 化学本质：绝大多数的是DNA（除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA质粒外） 绝大多数为cccDNA（covalently closed circularDNA，共价、闭合、环状DNA分子），极少的天然质粒是线状的 性质：对细菌的存活非必须，但常具有某些有利性状（如抗生素抗性）

质粒的各种表型 Plasmids are widely distributed throughout the prokaryotes, vary in size from less than 1 × 106 daltons to greater than 200 ×106, and are generally dispensable. Some of the phenotypes which these plasmids confer on their host cells are listed in Table 4.1. Aromatic:芳香的 Haemolysin：溶血素 Enterotoxin：肠毒素 Bacteriocin：细菌素 1.致育因子——F质粒 2.抗性因子——对各种抗生素、毒素、重金属离子等的抗性。 3.对其他细菌的抑制——如Col质粒（Col plasmid）之杀死附近不含Col质粒的细菌。 4.毒性——如苏云金杆菌含有编码δ内毒素（半孢晶体）的质粒，δ内毒素用作杀虫剂。 5.赋予额外代谢能力——樟脑质粒（CAM）、辛烷质粒（OCY） 6.也有不赋予任何表型的质粒——隐性质粒。 参考资料：微生物学（沈萍 陈向东） 质粒在原核生物中分布广泛，大小不一，从1-200×106 Da不等，通常非宿主所必需（dispensable）。常具有各种特殊表型，表（4.1）中已列出，如抗生素抗性、糖酵解、重金属抗性、诱导植物肿瘤等等。

Plasmid DNA Plasmids are replicons which are stably inherited in an extrachromosomal state. Most plasmids exist as double-stranded circular DNA molecules. If both strands of DNA are intact circles the molecules are described as covalently closed circles or cccDNA. If only one strand is intact, then the molecules are described as open circles or OC DNA. 染色体之外的可稳定遗传的复制子，多数为环状dsDNA分子 Q：什么叫复制子？ 绝大多数具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA 分子量范围：1－300kb，多数在10kb 双链完整，则为cccDNA(共价闭合环状DNA) 双链中只有一条完整，则为开环DNA(OC DNA)

1.2 Three conformations（三种构型） 松弛的cccDNA 开环的DNA(ocDNA) 超螺旋DNA(scDNA) DNA旋转酶 拓扑异构酶 内切酶 DNA连接酶 1.2 Three conformations（三种构型） When isolated from cells, covalently closed circles often have a deficiency of turns in the double helix, such that they have a supercoiled configuration. The interconversion of supercoiled, relaxed covalently closed circular DNA and open circular DNA. 在天然状态下，噬菌体Ф×174RF2的DNA就是开环DNA的形式。

Three conformations of plasmid DNA * Three conformations of plasmid DNA Because of their different structural configurations supercoiled and OC DNA separate upon electrophoresis in agarose gels. 开环DNA(ocDNA) 多数是在提取过程中或其他原因使超螺旋DNA(scDNA)分子上一条链被打断而形成一个切口，此时超螺旋DNA松开形成开环DNA分子。即使它们原系同一分子，但因其状态不同，如L(线状DNA)，OC，SC的区别，在凝胶电泳时的迁移率也不相同。ocDNA在电泳时通常跑得最慢。 开环DNA(ocDNA)往往是相对于超螺旋DNA(scDNA)、线状DNA(LDNA)而论，说明DNA分子结构上的一种状态。多数是在提取过程中或其他原因使超螺旋DNA分子上一条链被打断而形成一个切口，此时原超螺旋松开形成松弛(开)型的开环DNA分子。即使它们原系同一分子，但因其状态不同，如L，OC，SC的区别，在离心时的沉降系数(S)和凝胶电泳时的迁移率也不相同。ocDNA的沉降系数一般介于L和SC之间，而在电泳时它通常跑得最慢。在天然状态下，噬菌体Ф×174RF2的DNA就是开环DNA的形式。 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。 P105(图6-3)

1.3 分类 Plasmids can be categorized into one of two major type – conjugative or non-conjugative – depending upon whether or not they carry a set of transfer genes, called the tra genes, which promote bacterial conjugation. 根据是否带有一套的转移基因（tra）可分为结合型和非结合型两种 Tra基因可促使细菌发生结合

* Plasmid copy number 还可根据每个细胞中质粒拷贝数的多寡分为两类：松弛型和严紧型。 P106 Plasmids can also be categorized on the basis of their being maintained as multiple copies per cell (relaxed plasmids) or as a limited number of copies per cell (stringent plasmids). 质粒拷贝数：即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。

* Plasmid copy number Generally, conjugative plasmids are of relatively high molecular weight and are present as one to three copies per chromosome, whereas non-conjugative plasmids are of low molecular weight and present as multiple copies per chromosome . An exception is the conjugative plasmid R6K, which has a molecular weight of 25 ×106 daltons and is maintained as a relaxed plasmid. 严紧型质粒(stringent plasmids)：a limited number of plasmid copies per cell。接合型质粒，分子量大，低拷贝数，1－3拷贝（质粒 R6K例外） 松弛型质粒（relaxed plasmid）：Relaxed plasmids are plmids with multiple copies per cell。非接合型质粒，分子量小，高拷贝数，10－60拷贝，不会自行接合转移，较安全 多数情况下，含质粒的细胞只有一条染色体，但不排除存在多拷贝染色体的情况。 结合型质粒：分子量大，宿主广，拷贝数比较少，使用时要注意； 非结合型质粒：分子量小，拷贝数多，不会自行接合转移，比较安全。

1.4 Incompatibility of plasmids (质粒的不相容性) Plasmid incompatibility is the inability of two different plasmids to coexist in the same cell in the absence of selection pressure. The term incompatibility can only be used when it is certain that entry of the second plasmid has taken place and that DNA restriction is not involved. 质粒的不相容性:在没有选择压力的情况下，两种不同的质粒，不能在同一宿主细胞内稳定的共存的现象。 P107 不相容性质粒：不能共存于同一细胞内的不同质粒 相容性质粒：可以共存于同一细胞内的不同质粒

Molecular mechanism （质粒不相容性的分子机制） * Molecular mechanism （质粒不相容性的分子机制） Plasmids will be incompatible if they have the same mechanism of replication control. 相容性：两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内 不相容性：两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。不相容性的质粒组成不相容性群。

* Host range of plasmids The host range of a plasmid is determined by its ori region. Plasmids whose ori region is derived from plasmid Col E1 have a restricted host range: they only replicate in enteric bacteria, such as E. coli, Salmonella, etc. Other promiscuous plasmids have a broad host range and these include RP4 and RSF1010. Plasmids with a broad host range encode most, if not all, of the proteins required for replication. They must also be able to express these genes and thus their promoters and ribosome binding sites must have evolved such that they can be recognized in a diversity of bacterial families. 由于复制起始位点决定了质粒的宿主，在基因工程中就可以人为地针对某个特定的宿主制造某种质粒，只要这种质粒含有相应的复制起始位点，它就能在这个宿主中存在，而不必管这个质粒DNA上的其他结构。 不同的质粒有不同的宿主，但这都取决于质粒的复制起始位点。 来源于ColE1质粒的复制起始位点ori，决定了这种质粒的宿主只能是肠道来源的细菌。 而宿主范围广泛的质粒，则必须能表达多种蛋白才能适应不同的宿主。

Proteins encoded by plasmids * Proteins encoded by plasmids Plasmids encode only a few of the proteins required for their own replication and in many cases encode only one of them. All the other proteins required for replication, e.g. DNA polymerases, DNA ligase, helicases, etc., are provided by the host cell. Those replication proteins that are plasmid-encoded are located very close to the ori (origin of replication) sequences at which they act. Thus, only a small region surrounding the ori site is required for replication. Other parts of the plasmid can be deleted and foreign sequences can be added to the plasmid and replication will still occur. This feature of plasmids has greatly simplified the construction of versatile cloning vectors. 质粒本身编码的蛋白相当少，许多与复制有关的蛋白都由宿主提供； 质粒自身编码的与复制有关的蛋白则紧邻复制起点ori； 由于与质粒复制有关的序列都在ori附近区域，其他部位则可删除或替换成其他基因，这非常有利于克隆载体的构建。

* 1.6 质粒载体的选择 An ideal cloning vehicle would have the following four desirable properties（载体应具备的基本条件） low molecular weight(低分子量); ability to confer readily selectable phenotypic traits on host cells（筛选标记）; single sites for a large number of restriction endonucleases, preferably in genes with a readily scorable phenotype.（大量的内切酶酶切位点；多克隆位点） P107 Replication origin is also essential. (复制起始位点)——（质粒本身就具备这一特征。） 外源基因进入宿主细胞会受到很多限制，如：外源DNA很难进入受体细胞（没有相应的转移体系）；外源DNA一般不带复制子系统（细胞增殖过程中就容易丢失）；外源DNA一般不具备表达的调控系统（因此需要额外的调控元件）。因此就需要人工构建一个载体，帮助外源基因进入宿主细胞，以及在宿主细胞中的复制、增殖、表达等。 * 以增殖外源序列为目的（结构上主要为载体本身必需的序列，分子量较小） 克隆载体： 以表达外源序列为目的（结构上多了一些与外源基因转录、翻译有关的序列，分子量较大） 表达载体：

The advantages of a low molecular weigh （低分子量的优点） The plasmid is much easier to handle, i.e. it is more resistant to damage by shearing, and is readily isolated from host cells. （易处理，如抵抗物理剪切力强，易从宿主中分离提取） Low-molecular-weight plasmids are usually present as multiple copies, and this not only facilitates their isolation but leads to gene dosage effects for all cloned genes. （多为多拷贝形式，这样利于提取） With a low molecular weight there is less chance that the vector will have multiple substrate sites for any restriction endonuclease.(分子量低，则内切酶识别位点少) 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 转化效率与质粒DNA分子大小相关，小分子量的质粒转化率高；质粒克隆载体分子量小，可承载较大的外源DNA片断。

* 多克隆位点（MCS） Polylinker or multiple cloning sites (MCS) is a short DNA sequence, carrying sites for many different restriction endonulceases. （载体上人工构建的）一段短的DNA序列，携带有许多不同限制性内切酶识别位点。 An MCS increases the number of potentia cloning strategies available by extending the range of enzymes that can be used to generate a restriction fragment suitable for cloning. By combining them within an MCS, the sites are made contiguous, so that any two sites within it can be cleaved simultaneously without excising vector sequences.

1.6.1 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101 野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建 （1）分子量大，拷贝数低，酶切位点少 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子量9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。 1973年，世界上第一例有目的的重组实验所采用的质粒载体pSC101 1973年，美国加利福尼亚大学旧金山分校的波尔教授和斯坦福大学的斯坦力.科恩教授共同完成了一项著名的实验。他们选用了一个仅含有单一EcoRⅠ位点的质粒载体pSC101，并用EcoRⅠ将其切为线性分子，然后将该线性分子与同样具有EcoRⅠ粘性末端的另一质粒R6-3 的DNA片段用DNA连接酶混合，从而获得了具有两个复制起点位点的新的DNA组合。这是人类历史上第一次有目的的基因重组的尝试。 （2）筛选标志不理想 ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。 colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞. P110

人工改造的克隆载体pBR322及插入失活原理 pBR322是经人工改造的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，应用最为广泛。现在已经被许多更优良的新型克隆载体所替代。 分子量在历次的改造中有一定的变化（4362~4363~4361） P112 由于原始质粒的缺陷，就需要构建新质粒克隆载体以适应实验的要求。最早最为广泛应用的就是pBR322，共有24种核酸内切限制酶对pBR322DNA分子都只具有单一的识别位点。 构建载体的基本策略：能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）；含多克隆位点；含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记基因：Apr，Kmr，Smr， Tcr基因等；DNA分子尽可能小和较高的拷贝数；根据特殊需要，组装各种“元件”，构建不同用途的质粒克隆载体。 选择合适的出发质粒；正确获得构建质粒克隆载体的元件；组装合适的选择标记基因；选用合适的启动子；构建过程力求简单。 pBR322的优点： 具有较小的分子量，4361bp，可以克隆10kb以下的外源DNA。 含有松弛型质粒ColE1的复制起始位点，可在E.coli HB101 和 E.coli C600等受体细胞进行高拷贝复制。 具有两种选择标记基因Apr和Tcr。 Restriction map of plasmid pBR322(P115) “p”表示它是一种质粒； “BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F．Bo1ivar和R.L.Rodriguez姓氏的头一个字母， “322'’系指实验室编号，以与其他质粒载体如pBR325，pBR327，pBR328等相区别。

The pedigree of pBR322 (pBR322的谱系) The best, and most widely used of these early purpose-built vectors is pBR322. Plasmid pBR322 contains the ApR and TcR genes of RSF2124 and pSC101, respectively, combined with replication elements of pMB1, a Col E1-like plasmid (Fig. 4.7a). 复制起始位点：源于ColE1衍生质粒pMB1。 Apr基因：源于pSF2124质粒转座子Tn3。 Tcr：源于pSC101质粒。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： pSC101 8.8kb 拷贝数55 四环素抗性标记基因Tcr ColE1 6.5kb 拷贝数20-30 大肠杆菌内毒素标记基因E1 RSF2124 ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多也是由这少数几个野生型质粒构建的。 P116(图6-8)

pBR322的筛选方式：insertional inactivation（插入失活） * pBR322的筛选方式：insertional inactivation（插入失活） 其中有7种限制酶：EcoRV, NheI, BamHI, SphI, SalI, XmaIII和NruI，它们的识别位点是位于四环素抗性基因内部，另外有2种限制酶：ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr基因的失活； 还有3种限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨苄青霉素抗性基因（ampr）内具有单一的识别位点，在这个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。 这种因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。 酶切位点： Aprr基因区：PstI, ScaI, PvuI Terr基因区：BamHI, SalI, EcoRV, SphI, NheI, XmaIII, NruI Terr启动子区：ClaI，HindIII

* 筛选标记－插入失活 例如：将外源基因插入amp基因中，筛选步骤如下： 1将重组体转化菌落涂布含ter的培养基。无论是否插入，都对ter有抗性，所以菌落很多； 2从ter培养基上长出菌落后，采用印迹法用无菌的布原位将菌落印到amp培养基上； 3那些插入外源基因的则没法存活。可以在ter筛选培养基的对应位置找到重组菌落。 当外源DNA片段插入Tcr 基因后，导致Tcr 基因失活，使质粒变成只对amp有抗性。或者外源基因插入ampr基因中，则会导致ampr基因失活，这个质粒就变成只对Tc有抗性。这样通过对抗生素的双抗或单抗来筛选是否有外源片段插入。 P117(图6-9)

1.6.2 pUC18/19(a lac selection plasmid) （pUC18/19和蓝白斑筛选原理） pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19 pUC18/19：来源于pBR322，又有别于它，因为两者的筛选方式不一样。 University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成. P118(图6-12)

Structure of pUC18/19 ori：来自pBR322质粒。 Ampr gene：来自pBR322质粒 Promoter of lacZ：来自大肠杆菌 lacZ’ gene ：大肠杆菌lacZ的-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片段 MCS（mutiple cloning site,多克隆位点）：10个连续的单酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。 lacZ：半乳糖苷酶。它的作用底物是乳糖。本底表达的乳糖透过酶可将乳糖运输到细胞内部，于是同样本底表达的半乳糖苷酶可将乳糖转化成异构体——别乳糖后再将其降解成半乳糖+葡萄糖。生成的别乳糖是天然的诱导物，可与阻遏蛋白结合使之变构，由四聚体解聚成单体，导致其与操作子的亲和力下降1000倍，与操作子解离，从而使得RNA聚合酶能结合启动子快速启动结构基因的转录。 Smaller size: ~2.7kb Single step for selection the recombinant cells Multiply cloning sites：具有多克隆位点（MCS），方便不同粘性末端的外源DNA的插入。 High copy number:500-700 copies/cell 测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。 Genetic maps of some pUC plasmids.

-complementation（ —互补） * -complementation（ —互补） pUC质粒结构中的lacZ’基因所编码的—肽链（是β-半乳糖苷酶基因的N端末端）可参与-互补作用。这种载体适合于可编码β—半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然质粒和宿主编码的片段各自均无活性，但它们共处一个细胞中时可融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β—半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做—互补。

Q：lac操纵子的结构？ lacZ与乳糖、别乳糖、半乳糖的关系？ pUC18/19与pBR322在结构上的主要差别在于：用乳糖操纵子的一个DNA片段（466bp）替换了pBR322选择标记Tcr 基因——于是筛选原理也不同（蓝白斑筛选）。 此DNA片段含有乳糖操纵子的启动子、调节因子和β－半乳糖苷酶的α-肽基因。

blue/white screening(蓝白斑筛选) * blue/white screening(蓝白斑筛选) The activity of the enzyme b-galactosidase is easily monitored by including in the growth medium the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-galactoside (X-gal). This compound is colourless but on cleavage releases a blue indolyl derivative. On solid medium, colonies that are expressing active β -galactosidase are blue in colour while those without the activity are white in colour. This is often referred to as blue/white screening. Since Xgal is not an inducer of b-galactosidase, the non-substrate (gratuitous) inducer isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) is also added to the medium.

blue/white screening(蓝白斑筛选原理) * blue/white screening(蓝白斑筛选原理) 载体上：LacZ’基因（ carrying the N-terminal fragment of the lacZ gene，编码-半乳糖甘酶的N端部分，肽， 11-41aa）。 宿主： lacZ基因缺陷型，只表达-半乳糖甘酶的C端部分 插入了外源基因后，由于插入位置是LacZ’基因的5’端，基因结构被破坏，则不能产生肽，于是没有活性的-半乳糖甘酶，X-gal也不被水解，底物就仍为白色。 重组菌落就是白色，非重组菌就是蓝色。——所谓蓝白斑筛选。 没插入外源序列时，诱导物IPTG与LacI的基因产物——阻遏蛋白结合，使之转变为无活性形式而不能与操作子结合， LacZ’基因正常转录表达，产生的肽与宿主细胞产生的-半乳糖甘酶的C端部分互补，形成有活性的四聚体结构的β半乳糖苷酶，可将底物X-gal水解，产生蓝色化合物。

* Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）：是-半乳糖苷酶的作用底物，无色，但酶解后可生成有色物质——5-溴-4-氯靛蓝 IPTG：诱导物， 与LacI的基因产物——阻遏蛋白结合，使之转变为无活性形式而不能与操作子结合，于是RNA聚合酶就能起始LacZ’基因的转录（ 肽）。

* IPTG诱导的结果： 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。 MCS无外源基因插入时，互补，产生蓝色菌斑。（说明蓝色代表非重组子） MCS有外源基因插入时，不互补，产生白色菌斑。（说明白色代表重组子） 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。

* 1.6.3 T vector（T载体和TA克隆原理） 现象：普通的Taq酶会自动给PCR产物的3’末端添加一个A。 原理：普通的Taq酶能够在PCR产物3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的线性载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体MCS中。 操作最简单，快速和高效，是Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法 由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，用于PCR产物的克隆和测序。 PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。 利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。 注意事项 1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。 2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。 3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。 TA克隆的优点 不需使用含限制酶序列的引物；不需把PCR产物做平端处理；不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。 

pMD18-T图谱

pSK-T载体图谱 pSK-T vector两侧的3`端，具有突出的碱基T，可以和PCR产物3`末端的A碱基互补，从而大大提高PCR产物的连接、克隆效率。可通过α互补的颜色反应来筛选重组子 3’

pUC18-T克隆载体图谱

1.6.4 Ti plasmid(Ti质粒与植物基因工程) * 1.6.4 Ti plasmid(Ti质粒与植物基因工程) Ti（tumor-inducing plasmid）质粒：根癌农杆菌含有一种内源质粒，大小因种类而异，在200－250kb之间。当农杆菌同植物接触时，Ti质粒中有一段DNA，大约在15kb-30kb，称为T-DNA（transferred -DNA），能转移并整合到植物基因组中，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。 章鱼碱型 胭脂碱型 农杆碱型 农杆菌素型 琥珀碱型 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类，Ti 质粒进行分类 由于载体上还会有其他与翻译有关的基因构建，因此Ti质粒是一种表达载体。

冠瘿瘤和根癌农杆菌 上： 电镜下的根癌农杆菌 下： 冠瘿瘤 把瘤组织培养在不加生长素和细胞分裂素的培养基上，能够无限制的分裂和生长。

* Ti质粒分为4个功能区： T－DNA区：从Ti质粒上被切割下来转移到植物细胞的一段DNA，含有编码植物激素（生长素）和冠瘿碱的基因 Vir区：Vir区上的基因能激活T-DNA转移，使根癌农杆菌表现出毒性 Con区：与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移 Ori区：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。 在T－DNA已鉴定出多种基因 章鱼碱合成基因（ocs）或胭脂碱合成基因（nos）或其他胭脂碱合成基因。 细胞分裂素合成基因位点Shi 和 控制植物生长素合成的基因位点Roi。 在两种基因表达产物的共同作用下，破坏植物内源激素的平衡，干扰植物细胞的正常分裂，引发植物产生肿瘤。

章鱼碱型pTiAch5和胭脂碱型pTic58质粒基因图 T－DNA区 Con区 Ori区 Vir区 章鱼碱型pTiAch5和胭脂碱型pTic58质粒基因图

* T-DNA Complete Ti-plasmid DNA is not found in plant tumour cells but a small, specific segment of the plasmid, about 23 kbp in size, is found integrated in the plant nuclear DNA at an apparently random site. This DNA segment is called T-DNA (transferred DNA). It carries genes that confer both unregulated growth and the ability to synthesize opines upon the transformed plant tissue. However, these genes are non-essential for transfer and can be replaced with foreign DNA. Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约23kb。能转移到植物细胞内的这一小段DNA片段称为T－DNA（transferred-DNA） P238

border sequence(边界序列) * border sequence(边界序列) In the Ti plasmid itself, the T-DNA is flanked by 25 bp imperfect direct repeats known as border sequence. T－DNA左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列(左边界(left border, LB) ，右边界(right border, RB))，在不同Ti质粒中高度保守。它在T-DNA的切除及整合过程具有重要意义。右边界的存在对外源基因整合到植物基因组中相当重要，但左边界则非必须。 Deletion of the right border repeat abolishes T-DNA transfer, but the left-hand border surprisingly appears to be non-essential. 边界序列对T－DNA转移和整合不可缺少；已证实只要保留两端边界序列，虽然中间序列不同程度被外源片断所替换，仍可转移整合到植物基因组中－ Ti质粒遗传转化的理论依据。 T－DNA进入植物细胞后，能以单拷贝或多拷贝形式随机整合到染色体DNA上。且T－DNA上的基因能被植物转录系统识别，进行转录。 P238

Ti质粒作为转基因载体的缺陷 转化后会产生植物激素，阻碍转化细胞的再生（因此这部分基因序列要删除）； 冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不大（因此这部分基因序列也要删除） ； Ti质粒长约200-800kb ，过于庞大（因此要删除部分无关紧要的序列） ； Ti质粒不能在大肠杆菌中复制（因此要增加大肠杆菌的复制起始位点）。 左右边界序列要保留。

植物表达载体pCAMBIA 1300 图谱 质粒载体 左边界 右边界 植物标记基因，MCS 右边界 来源于CaMV的启动子 潮霉素抗性基因 Ti质粒本身存在的缺陷： 转化细胞在生长过程中会产生植物激素，从而破坏受体激素的平衡，阻碍转化细胞的再生，因此需将参与合成植物生长素和细胞分裂素的基因剔除；冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不大，因此也可删除；Ti质粒分子量过大（200～800kb），小一些利于操作，因此可除去不必要的大片段DNA；需加入大肠杆菌复制起始位点，以利于在大肠杆菌中的操作和保存。 左边界 卡那霉素抗性基因 参：P244(图10-9) 在大肠杆菌中的复制起点

Gus基因（报告基因） 右边界 左边界 大肠杆菌的复制起点

CaMV 35S启动子 是植物基因工程中常用来构建表达载体的一个启动子序列 来自花椰菜花叶病毒，由于启动整个CaMV基因组的一小段重叠序列转录产物的沉降系数为35S，故将编码该转录产物的启动子称之为35S启动子。 该启动子包括TATA盒、CAAT盒、倒转重复序列和增强子核心序列（GTGG/TTTG）。 CaMV35S启动子加上来自AMV（苜蓿花叶病毒）的一段44bp的引导序列，可使其表达强度增加5倍（44bp序列是翻译增强序列）。 将加倍的CaMV35S启动子与AMV引导序列结合构成一个复合串联启动子，比未修饰的启动子表达增强20倍。

其他类型的启动子 马铃薯块茎特异蛋白基因启动子 小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（ADPG-lucose pyrphosphorylase)启动子 番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturnase)启动子 花粉特异表达基因启动子（lat 52） 木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因(pal)启动子

* 报告基因 是标记基因的一种。通常其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因，不需要依赖外界的压力。 常见的有： 1、绿色荧光蛋白基因（GFP ，green fluorescence protein ） 2、B-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因，b-D-glucuronidase ） 3、荧光素酶基因（LUC ，fire fly luciferase ） 4、氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因）

Jellyfish Aequorea victoria: one of the oldest species on the earth

* 绿色荧光蛋白（GFP） GFP的首个重大改变是钱永健在1995年完成。GFP的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm，而发射峰仍保持在509 nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。 Heim, R., Cubitt, A.B., &Tsien R.Y.Improved green fluorescence.Nature. 1995 Feb 23; 373(6516): 663-4.

GFP标记的微管 表达绿色荧光蛋白的线虫

* GUS基因 GUS基因就是β-葡萄糖苷酸酶基因 。该基因产物为β-葡萄糖苷酸酶，是一种水解酶，相当稳定而不易降解。 测定方法非常简单，且可使用底物 在原位 显现出酶的活性，以肉眼即可检测其产物，非常方便。 常用的组织化学方法检测GUS基因的表达： 以无色的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若该组织细胞含有gus基因且有表达，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织、甚至单个细胞内的表达情况。 在测定时，由于植物体内的过氧化物酶能促进氧化二聚作用，使颜色加深，所以染色程度不能准确反映Gus活性。

用GUS活性检测转基因拟南芥 A：组成型启动子CaMV35S的转基因拟南芥 B：根特异性启动子PsMTA的转基因拟南芥  

转基因烟草萌发花粉的GUS 组织化学染色 CK-

GUS基因组织化学染色 GUS基因GU 35S-茎横切 CK-茎横切

* 选择基因（筛选标记基因） 也是标记基因的一种。选择基因（又称选择标记基因或筛选标记基因），其编码产物可使抗生素或除草剂失活。这种基因在执行其选择功能时，通常存在检测慢（蛋白酶作用需要时间）、依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂）等缺陷。 主要是各种抗生素抗性基因、使除草剂失活的基因

其他 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vecotr） 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、因此可以在两种不同的寄主细胞中复制和存活的质粒载体。如： 大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌动物细胞穿梭载体 穿梭载体的优点 ① 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 ② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 ③ 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。

2 噬菌体载体 2.1 λ vector 2.2 M13 vector

2.1 λ vector（  λ 载体） The DNA of phage λ, in the form in which it is isolated from the phage particle, is a linear duplex molecule of about 48.5 kbp. 线性双链DNA分子，长度为48.5kb(48502bp);蛋白质外壳 1982年由Sanger等完成测序 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下这两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 高效率高特异性侵染宿主细胞(这种高感染性能使外源基因高效导入受体细胞) 自主复制繁殖性能使外源基因在宿主细胞中高效扩增

* 2.1.1 Cos site (cos位点,科斯位点) At each end of phage λ are short single-stranded 5’ projections of 12 nucleotides, which are complementary in sequence and by which the DNA adopts a circular structure when it is injected into its host cell, i.e. λ DNA naturally has cohesive termini, which associate to form the cossite. 在λDNA分子两端各有12nt的单链5’粘性末端，且两者的核苷酸序列互补，当λ噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端互补配对而成双链环状DNA分子，这种由噬菌体粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点（cohesive end site）

Replication of phage-λ DNA in lytic and lysogenic cycles. 吸附 Cos位点成环 溶源周期 特异性重组 双向复制及早期基因转录 滚环复制及后期基因转录 头部的包装 尾部的包装 宿主裂解 * 2.1.2 Life cycle of phage λ 溶源周期：cos连接成环后，噬菌体与宿主细胞进行位点特异性重组，将自身基因组重组到宿主染色体中，随宿主染色体的复制而复制； 裂解(溶菌)周期：cos连接成环后DNA双向复制，复制到后期变成滚环复制形式大量增殖DNA，头部蛋白大量表达，同时将DNA切割成一个个单独λ基因组后包装进成熟的噬菌体头部，尾部蛋白加到头部形成成熟的噬菌体，最后裂解宿主细胞。 裂解周期分三个阶段： 早期——早期基因它的转录定下了裂解周期的基调； 中期——中期基因产生复制和重组； 后期——后期基因将DNA分子包装进成熟的噬菌体外壳（P55）

2.1.3 genome of phage λ 左臂：从A到J长约20kb，编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 要保留。 右臂(N-R)：长约10kb，与调控、DNA合成、免疫、后期功能控制、宿主细胞裂解有关。要保留 中段(J-N)：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列 ，但非裂解生长所必需，可删除。 至少包括61个基因。 Functionally related genes of phage λ are clustered together on the map, except for the two positive regulatory genes N and Q. λDNA大多数编码基因均是按功能的相关性成簇排列，除了调节基因N和Q。 Much of this central region is not essential for phage growth and can be deleted or replaced without seriously impairing the infectious growth. （中部区域的序列，J基因→N基因：约占λDNA总长度三分之一，对于λ噬菌体的裂解生长而言是非必需的，这一区段的缺失或在此段插入外源DNA片段，将不影响入噬菌体的增殖。这是λ噬菌体可作为基因工程载体的一个重要的依据。） (P53) To the right of the central region are genes concerned with regulation and prophage immunity to superinfection (N, cro, cI), followed by DNA synthesis (O, P), late function regulation (Q) and host cell lysis (S, R). (P53)（右边的序列则与调控、免疫、DNA合成、后期功能调控、宿主细胞裂解化(溶菌化)等有关。必需） Genes on the left of the conventional linear map (Fig. 4.10) code for head and tail proteins of the phage particle. Genes of the central region are concerned with recombination (e.g. red) and the process of lysogenization. （基因组左臂序列编码头部和尾部的蛋白质的合成；中部区域的基因则与重组和溶源化有关，但对裂解生长非必需，可删除 (因为在这里插入外源序列并不影响噬菌体的增殖)）

利用λ噬菌体作载体，主要是将外源基因替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的裂解（溶菌）繁殖而繁殖。 设计去除λDNA上的多余序列和一些限制性酶切点：因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。 左臂序列 右臂序列 中段序列

* 2.1.4 Capacity ofλ vector （λ噬菌体的容量） phage λ can accommodate only about 5% more than its normal complement of DNA. λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型DNA总量的5％左右，而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75％。 （75%~105%） 按野生型λDNA分子长度为 48.5kb计算，λ噬菌体的包装上限是 51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。 这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。 野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。 理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右。但在一般的情况下，15kb左右大小的DNA片段已足够容纳一个完整的基因及其两端的侧翼序列。

* 2.1.5 Type of λ vector Derivatives of the wild-type phage have therefore been produced that either have a single target site at which foreign DNA can be inserted (insertional vectors) or have a pair of sites defining a fragment that can be removed (stuffer) and replaced by foreign DNA (replacement vectors). 只具有一个限制酶位点，可便于外源DNA插入的称为插入型载体，i.e. λgt10， λgt11 插入型载体 （insertional vectors ） 置换型载体 （replacement vector） 含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代，i.e. λEMBL3、λEMBL4） Most of these vectors were constructed for use with EcoRI, BamHI or HindIII, but their application could be extended to other endonucleases by the use of linker molecules.

置换型载体：λEMBL3 and λEMBL4 The most recent generation of λ vectors, which are based on EMBL3 and EMBL4, have a capacity for DNA of size 9–23 kb. The structure of bacteriophage λ cloning vectors EMBL3 and EMBL4. The polylinker sequence is present in opposite orientation in the two vectors.

2.2 M13 vector（ M13 噬菌体载体） M13, f1 and fd are filamentous coliphages containing a circular single-stranded DNA molecule. The phage particles have dimensions 900 nm ×9 nm and contain a single-stranded circular DNA molecule, which is 6407 (M13) or 6408 (fd) nucleotides long. The complete nucleotide sequences of fd and M13 are available and they are 97% homologous. M13、f1和fd，是一类丝状大肠杆菌噬菌体，它们都含有长度为6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状DNA分子。 由外壳包装蛋白和正链DNA(+ssDNA)组成。 感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。  M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。 These coliphages have been developed as cloning vectors, for they have a number of advantages over other vectors, including the other two classes of vector for E. coli, plasmids and phage λ.

Life cycle of M13 M13吸附并通过大肠杆菌的雄性鞭毛内孔注入其+ssDNA，以+ssDNA为模板合成-DNA，形成dsDNA （RFDNA）；再以-DNA为模板滚环复制，拷贝数100-200时复制停止；编码基因表达出蛋白质，包装正链并分泌至体外；虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/2—3/4） 噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然后穿过鞭毛内孔将DNA注入细菌体内。单链DNA利用宿主细胞复制另一条链（负链），形成双链DNA（RFDNA），然后以负链为模板，进行滚环式复制，当滚环复制的单链DNA拷贝数达到100-200时，负链上的基因产物干扰复制，使其停止，同时，由两条链上编码的蛋白基因表达，包装正链，并分泌至体外，宿主细胞不会发生裂解。细菌细胞每分裂一次，大约可以释放1000个新的病毒颗粒。 Life cycle and DNA replication of phage M13.

advantages of M13 vector 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA（replicative form DNA）。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。 RF can be purified and manipulated in vitro just like a plasmid（在体外易于象质粒一样进行纯化和操作） both RF and ss DNA will transfect competent E. coli cells to yield either plaques or infected colonies(筛选方便，可感染感受态大肠杆菌细胞。被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大) it is very easy to determine the orientation of an insert. （很容易测定外源DNA 片段的插入方向（因此被用于测序）） In summary, as vectors, filamentous phages possess all the advantages of plasmids while producing particles containing single-stranded DNA in an easily obtainable form. （总之，M13拥有所有质粒的好处，同时又能以一种很容易获得的形式产生包含ssDNA的颗粒） 这些丝状噬菌体表现出一系列其它载体所不具备的优越性： 　　第一，单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介的。这种复制形式的DNA（replication form DNA，简称RFDNA）,可以如同质粒DNA一样，在体外进行纯化和操作。 　　第二，不论是RF DNA还是ssDNA，它们都能够转染感受态的大肠杆菌寄主细胞，并依据所采用的实验方法而定，或产生出噬菌斑，或形成浸染的菌落。 　　第三，单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡制约的。因此对它们来说，并不存在包装限制的问题。 　　第四，应用这类单链DNA噬菌体，可以容易地测定出外源DNA片段的插入取向。 　　第五，可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。这种重组体单链DNA分子可按双脱氧链终止法作核苷酸序列测定，也可用于制备具放射性同位素标记的DNA探针，还可进行寡核苷酸定点突变。 但M13--DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb

Application of M13 vector * Application of M13 vector 可产生大量纯化的含外源DNA片断的单链DNA分子。 Sequencing by the original dideoxy method required single-stranded DNA（测序） oligonucleotide-directed mutagenesis（寡核苷酸定点突变） probe preparation（制备探针） 序 M13载体发展出来，用于测序。 从细菌中释放出来的噬菌体颗粒只含单链DNA，因此可用来作为对DNA测序的模板；另外，可很方便地用来产生单链的DNA探针。

3 cosmid cloning vector （柯斯质粒载体） * 3 cosmid cloning vector （柯斯质粒载体） Plasmids have been constructed which contain a fragment of λ DNA including the cos site. These plasmids have been termed cosmids and can be used as gene-cloning vectors in conjunction with the in vitro packaging system. “cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指携带有λ噬菌体cos位点的质粒。 1970年代重组DNA技术刚刚兴起，那时能用于基因克隆的载体只有质粒载体和λ噬菌体载体。所以当时的载体选择十分有限。后来M13载体发展出来，用于测序。 大量的研究资料表明，许多基因的分子大小比正常预期的要大得多，有的可达35～40kb甚至更大。同时，应用λ噬菌体作载体，还往往不能够同时克隆两个连锁的基因。不言而喻，在实际的研究工作中，特别是有关真核基因的结构与功能的研究，需要比λ噬菌体载体具有更大克隆能力的新型的载体。 cosmid克隆载体：由质粒和含有cos位点的λDNA片段组装的一类新型克隆载体。实际上是质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒。 1978年，发展出的柯斯质粒载体满足了人们对克隆大片段序列（超过30-40kb）的需要。

* cosmid 如果将λ噬菌体的左臂、右臂和中段都去除，仅保留λDNA两端不少于280bp并含有cos位点以及与包装相关的序列，再加上质粒的复制序列、筛选标记基因、多克隆位点等。连接上外源序列后，只要保证最终的长度大于36.4kb，小于51kb，就能进行有效地包装和转导。 这样构建的载体，既能用外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌（包装、感染——噬菌体的性质），之后又能以质粒的形式在细菌中增殖而被克隆（筛选、增殖——质粒的性质）。因此被称为柯斯质粒（cosmid）。 In fact, only a small region in the proximity(附近) of the cos site is required for recognition by the packaging system. Q：还记得什么是cos位点吗？

Feature of cosmid cloning vector * Feature of cosmid cloning vector cos质粒：环状dsDNA分子，一般在10kb以下，具有噬菌体和质粒两种特性： λ噬菌体的特性： 含cos位点及包装相关序列，可以高效地包装成噬菌体颗粒，并感染敏感的大肠杆菌寄主细胞。含有一个cos位点，能提供体外包装必需的cos末端。 After packaging in vitro, the particle is used to infect a suitable host. The recombinant cosmid DNA is injected and circularizes like phage DNA but replicates as a normal plasmid without the expression of any phage functions. Transformed cells are selected on the basis of a vector drug-resistance marker.（P64） 载体可插入外源DNA后，然后用外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后（包装、感染——噬菌体的性质），DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆（筛选、增殖——质粒的性质）。 可以质粒的形式在大肠杆菌中复制、用抗生素筛选 质粒的特性： 由于柯斯质粒载体并不含有且噬菌体的全部必要基因，因此它不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。因此cosmid是通过质粒的方式进行增殖而非噬菌体的方式增殖。

* Capacity of cosmid 高容量的克隆能力：分子量较小，能承载比较大的外源片段，被广泛地应用于构建基因组文库 具有包装侵染性质的噬菌体的总DNA大小在36－51kb之间，而柯斯质粒本身大小为5～6kb，因此它的克隆能力（接纳外源DNA的能力）应该是31-45kb。所以这种载体主要用于大片段的克隆或DNA文库的构建。 高容量的克隆能力：分子量较小，能承载比较大的外源片段，被广泛地应用于构建基因组文库

* 利用柯斯质粒克隆外源基因的过程 Digesting cosmid vector and foreign DNA respectively with the same restriction endonulease Joining reaction Packaging recombinant DNA into mature particles Infecting sensitive E.coli Screening with antibiotic resistance 酶切、连接、切割成噬菌体基因组大小、包装成噬菌体、侵染大肠杆菌细胞；然后再按照质粒的方式进行筛选、增殖。 Simple scheme for cloning in a cosmid vector. 在柯斯质粒载体中克隆的简化示意图

* 利用柯斯质粒克隆外源基因的过程 利用Cosmid进行克隆 BamHI酶切获得目的序列； 载体用BamHI酶切获得线性载体； 连接反应； 形成载体与外源序列的concatamer(串联体)； 切割成噬菌体基因组大小后，体外包装进噬菌体； 感染大肠杆菌，通过抗生素筛选、增殖； 利用Cosmid进行克隆

4 人工染色体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，因此科斯质粒（cosmid，容量约45kb）和噬菌粒载体（phagemid，容量约10kb）的装载量也远远不能满足需要。 New cloning vector developed for handle larger DNA: (P68-69) 1. P1 vector（P1 噬菌体载体）: 70kb-100kb 2. Bacterial artificial chromosomes (BACs,细菌人工染色体): ≦300kb 3. P1-derived artificial chromosomes (PACs， P1 噬菌体来源的人工染色体): 100kb-300kb 4. Yeast Artificial Chromosomes (YAC，酵母人工染色体):200kb-2000kb 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。 　　噬菌粒具有一下令人瞩目的特征：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。

* 不同克隆载体允许的最大DNA插入

4.1 P1 vector Phage P1 is a temperate bacteriophage(温和噬菌体) Sternberg and co-workers have developed a P1 vector system which has a capacity for DNA fragments as large as 100 kb. Thus the capacity is about twice that of cosmid clones but less than that of yeast artificial chromosome (YAC) clones.（装载容量约70-100kb） This P1 system has been used to construct genomic libraries of mouse, human, fission yeast and Drosophila DNA.（已用P1载体构建了小鼠、人类、裂殖酵母和果蝇DNA的基因组文库） P1噬菌体载体：是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的，与cosmid载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70～100kb 大小的基因组DNA片段（Sternberg,1990,1992,1994）。

artificial chromosomes * artificial chromosomes 将细菌性因子F质粒或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成人造染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前最常用的人造染色体载体主要有： 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC）

artificial chromosomes 酵母人工染色体(yeast artificial chromosomes，YAC) 细菌人工染色体(bacterial artificial chromes，BAC) P1噬菌体及其衍生人工染色体(P1—derived artificial chromosomes，PAC) 可转化人工染色体(transformation-competent artificial chromosomes，TAC) 哺乳动物人工染色体(mammalian artificial chromosomes，MAC) 人类人工染色体(human artificial chromosomes，HAC) 植物人工染色体(plant artificial chromosome，PAC)

4.2 细菌人工染色体 （Bacterial Artificial Chromosomes BAC） * This BAC system (bacterial artificial chromosome) is based on the single-copy sex factor F of E.coli. 细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50kb - 300 kb之间。 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持1到2个拷贝 用BAC构成的库要比用YAC的好得多。YAC转化率低，分离得到DNA难，使构建物理图的工作量大增；更伤脑筋的是，YAC重组率高，这不仅使构建物理图的难度增加，而且更容易引入误差。YAC的优点是插入的DNA片段的长度比BAC的长。如构建水稻基因组的文库用BAC已足够了。 pBACs主要适用于: 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因组文库

The first BAC vector：pBAC108L Two widely used BAC vectors, pBeloBAC11 and pECBAC1, are derivatives of pBAC108L in which the original cloning site is replaced with a lacZ gene carrying a multiple cloning site. Fig. 5.5 Structure of a BAC vector derived from a mini-F plasmid. (衍生于一个微型F质粒的BACk载体) parA和parB基因将是BAC在细菌中的拷贝数维持在每个基因组中为一个到两个。 The oriS and repE genes mediate the unidirectional replication of the F factor, while parA and parB maintain the copy number at a level of one or two per genome.

4.3 酵母人工染色体载体 (Yeast Artificial Chromosomes YAC) * 4.3 酵母人工染色体载体 (Yeast Artificial Chromosomes YAC) 酵母人工染色体(YAC)是一类酵母穿梭载体。 利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。 YAC具有酵母的自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受200kb-2000kb的外源DNA片段。 主要用途：构建基因组文库 80年代初，人造染色体就诞生了，利用酵母的各组成部分构建出具有完整功能的酵母染色体。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含 16 条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有14×106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。 YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。

* YAC载体应含有以下元件 YAC载体的装载量为350-400kb Q：染色体的三要素？ CEN4 ARS1 EcoRI 酵母染色体端粒序列（TEL） 酵母染色体自主复制序列（ARS1） 酵母染色体着丝粒序列（CEN4） 酵母系统的选择标记（URA3、TRP1） 大肠杆菌复制起始位点（ori） 大肠杆菌的选择标记（Apr） TRP1 pYAC4 Apr URA3 两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构； 在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff, HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增。 上述ARS、CEN、TEL 3个关键序列是染色体自主复制功能起码的，也是足够的结构基础。所有真核染色体中都含有这3个功能元件。用DNA重组技术将这3个元件分别从染色体上分离出来，并按顺序重组就构成所谓的“人造微小染色体” (artificial minichromosome)这种线状小染色体转化进入酵母细胞可以进行正常的复制和有丝分裂。这种小染色体经过改造，组装上作为载体所必须的其他功能序列，就可以成为人工染色体载体。由于真核染色体分子很大，所以这种载体可以插入很大的片段。 ori YAC载体的装载量为350-400kb TEL TEL BamHI

5 Specialist-purpose vectors Vectors that can be used to make single-stranded DNA for sequencing (测序：M13或pUC系列载体) Expression vectors 表达载体(真核、原核) Vectors for making RNA probes 制备RNA探针的载体 Vectors for maximizing protein synthesis 最大量合成蛋白质的载体 Vectors to facilitate protein purification 简化蛋白纯化的载体(融合型表达载体) Vectors to promote solubilization of expressed proteins 促进表达蛋白溶解的载体 Vectors to promote protein export 促进蛋白外运的载体(分泌型表达载体)

* 与外源基因表达有关的影响因素 很重要，课外自学。

包涵体 （ inclusion bodies） * 包涵体 （ inclusion bodies） 在大肠杆菌中外源蛋白的过量表达，造成的一个问题是大量的外源蛋白会聚集形成不溶于水的聚合体，这被称之为包含体（包涵体）。 One of the problems associated with the overproduction of proteins in E. coli is the sequestration of the product into insoluble aggregates or ‘inclusion bodies’(包含体/包涵体) . Fig. 5.16 Inclusions(包含体) of Trp polypeptide–proinsulin fusion protein in E. coli. 左：固定在对数生长晚期的细胞扫描电子显微镜照片(插入未正常的大肠杆菌细胞);右：通过产生Trp多肽-胰岛素A链融合蛋白的大肠杆菌细胞切片

6 joining DNA（DNA的连接） Ligation: the final step in construction of a recombinant DNA molecule.

Three enzymes for joining DNA fragments DNA ligase: to join covalently the annealed cohesive ends T4 DNA ligase: require ATP E.coli DNA ligase: NAD+ T4 DNA ligase: catalyse between blunt-ended fragments Terminal deoxynucleotidyltransferase（末端脱氧核苷酸转移酶，TdT）: to synthesize homopolymeric 3’ single-stranded tails. E.coli DNA ligase will usually not catalyse blunt ligation.（大肠杆菌来源的DNA连接酶不能催化平末端的连接。）

* 粘性末端 平末端 和平末端相比，同样的粘性末端的连接比较容易，效率较高。 A:同种内切酶产生的粘性末端的连接（DNA连接酶，效率快） B:同尾酶产生的粘性末端的连接（DNA连接酶，效率快） C:不同粘性末端的连接（补平成平末端，DNA连接酶） A:平末端的直接连接（T4 DNA连接酶） B:给平末端修饰后的连接（同聚物加尾，T4 DNA连接酶） C:加上连杆（ linker ），酶切使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接 D:DNA接头(adapter)连接法 平末端 DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。应用DNA连接酶这种特性，可在体外将具有粘性末端的DNA限制片段，插入到适当的载体分子上，从而可以按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子。 和平末端相比，同样的粘性末端的连接比较容易，效率较高。

6.1 粘性末端的连接 A：同种内切酶产生的粘性末端直接用连接酶连接。 DNA ligase GAATTC CTTAAG 5' GAATTC EcoRI G CTTAA 5' 5' AATTC G G CTTAA AATTC DNA ligase annealing G CTTAA AATTC 5' G CTTAA 5' AATTC

Use of DNA ligase to create a covalent DNA recombinant joined through association of termini generated by EcoRI.

B：同尾酶产生的粘性末端直接用连接酶连接。 TGATCA ACTAGT 5' GGATCC CCTAGG 5' BclI BamHI T ACTAG 5' 5' GATCA T G CCTAG GATCC annealing DNA ligase 来源各异，识别的靶序列也不相同，但切割后的DNA片段具有相同的黏性末端，这样的一组限制性内切酶称为同尾酶。 G CCTAG GATCC 5' GATCA T ACTAG G CCTAG GATCC 5' GATCA T CTTAA

C：不同的粘性末端，可处理成平末端后连接。 CTGCAG GACGTC 5' GGATCC CCTAGG 5' PstI BamHI CTGCA G 5' 5' G ACGTC G CCTAG GATCC T4-DNA pol 切平 Klenow 补平 C G 5' 5' G C GGATC CCTAG GATCC CTAGG T4 DNA聚合酶具有3‘→5’外切核酸酶的活性，是从一种携带有高表达T4 DNA聚合酶质粒的大肠杆菌中提纯制备的。 应用：3‘突出末端平滑化（1，2） ；5’突出末端补平（3） ；单链删除后亚克隆（3） ；基因定位突变中的第二条链的合成（4）；通过置换合成法（replacement synthesis）对DNA探针进行标记。 http://www.ebiotrade.com/buyf/productsf/new%20england%20biolabs/M0203L.htm T4 DNA ligase G CCTAG GATCC 5' GATCG C GCTAG G CCTAG GATCC 5' GATCG C GCTAG

* 6.2 平末端的连接 A：直接用T4DNA连接酶连接； B：给平末端修饰后的连接：先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接； C：用DNA连杆（linker）连接平末端； D：用DNA接头（adapter）连接平末端。 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。 平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。

5’…G--C--T--C--T--G-OH A：直接用T4DNA连接酶连接平末端 5’…G--C--T--C--T--G-OH 3’…C--G--A--G--A--C-P P-C--A--G--G--A--G … 3’ OH-G--T--C--C--T--C … 5’ T4 DNA ligase 在存在ATP和加入高浓度酶的条件下，它还能够连接具有完全碱基配对的平末端的DNA分子。这种反应的原因目前尚不清楚。但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。 5’…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G … 3’ 3’…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C … 5’ Q：内切酶切割DNA后产生的平末端，可以用大肠杆菌DNA连接酶连接吗？

B：给平末端修饰后的连接：平末端经同聚物加尾后，再用DNA连接酶连接 DNA片段平末端利用同聚物加尾后连接（用末端转脱氧核苷酰酶（TdT）给平末端的DNA片段加上poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dC)、 poly(dG)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来） 粘性末端修饰成平末端后再连接 TdT：末端脱氧核糖核苷酸转移酶。一般自牛胸腺中分离。带有突出或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。通过同聚物加尾以构建重组DNA分子。 由核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸。一般操作：先在载体上打开一单个位点，把它与末端转移酶和某一dNTP（如dATP）一起保温以使添尾，另一待插入的外源DNA片段则用互补的用同法添dNTP（dTTP）用同法添尾。接着使上述两种都接上互补单链尾的DNA片段彼此退火，使形成一杂合载体来转化受体菌。杂合载体中的裂隙或切口可被受体菌所修复。

3’粘性末端直接同聚物加尾后，用连接酶连接 CTGCA 3' G 3' ACGTC 5' SphI GCATG3’ C 5' 3’GTACG PstI TdT dGTP TdT dCTP GCATGCCCCCC3’ C 5' 5' C 3’CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 3' G 3' GGGGGGACGTC 5' annealing CTGCAGGGGGG G GGGGGGACGTC 5' GCATGCCCCCC C CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG G GGGGGGACGTC 5' GCATGCCCCCC C CCCCCCGTACG PstI酶切位点 Klenow T4DNA ligase CTGCAGGGGGG GACGT TGCAG GGGGGGACGTC GCATGCCCCCC CGTAC 5' CATGC CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG GACGT TGCAG GGGGGGACGTC GCATGCCCCCC CGTAC 5' CATGC CCCCCCGTACG

Use of calf-thymus terminal deoxynucleotidyl transferase (小牛胸腺末端转脱氧核苷酰酶)to add complementary homopolymer tails to two DNA molecules. TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）：催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3’-OH末端 TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）： Terminal deoxynucleotidyl transferase: to synthesize homopolymeric 3’ single-stranded tails.

5’粘性末端补平成平末端后再同聚物加尾，然后用连接酶连接 G CCTAG GATCC 5' EcoRI BamHI G CTTAA 5' 5' AATTC G Klenow 补平 Klenow 补平 GAATT CTTAA 5' 5' AATTC TTAAG GGATC CCTAG GATCC CTAGG 5' TdT dGTP TdT dCTP GAATTGGGGGG CTTAA 5' 5' AATTC GGGGGGTTAAG GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCCCCCTAGG 5' BamHI酶切位点 T4DNA ligase GAATTGGGGGG CTTAA 5' AATTC GGGGGGTTAAG GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCCCCCTAGG GAATTGGGGGG CTTAA 5' AATTC GGGGGGTTAAG GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCCCCCTAGG

* C:DNA连杆(linker)连接法 连杆(1inker)：用化学方法合成的10～12bp的一段寡核苷酸片段、两端都是平末端的、内部具有一个或数个限制酶识别位点。（本教材称之为衔接物。P144） 如果重组体DNA是用平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么很可能无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决这个问题，可采用连杆法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。 DNA片段末端加上化学合成的连杆或接头，能形成粘性末端，连接后可用内切酶进行切割。 Linker: A synthetic, double-stranded oligonucleotide used to attach sticky ends to a blunt-ended molecule. It is blunt-ended, but contains a restriction site. Q：nt和bp各代表什么？

DNA连杆(linker) Decameric，（deca-：10的） 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化； 然后再通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来； 接着用适当的限制酶消化具有连杆的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。 于是便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。 A decameric linker molecule containing an EcoRI target site is joined by T4 DNA ligase to both ends of flush-ended foreign DNA. Cohesive ends are then generated by EcoRI. This DNA can then be incorporated into a vector that has been treated with the same restriction endonuclease.

D:DNA衔接物(adapter)连接法 * D:DNA衔接物(adapter)连接法 DNA衔接物(adapter)：于1978年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，且在5’端羟基化以防自身聚合，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。 （本教材称之为接头。P145） 当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。 DNA连杆连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的连杆相同的限制位点，这样在酶切消化连杆产生粘性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。 当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的连杆，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头(adapter)连接法。 吴瑞（1928-2008） 2008年2月10日，吴瑞教授在康奈尔大学去世。

Adapter：一边是正常的平末端，另一边含内切酶位点的粘性末端，但在其5’端羟基化以防自身聚合。 Polynucleotide kinase:催化5’末端发生磷酸化以便能与3’末端正常连接。 Hydroxyl：羟基 Use of a BamHI adaptor molecule. A synthetic adaptor molecue is ligated to the foreign DNA. The adaptor is used in the 5’-hydroxyl for to prevent self-polymerization. The foreign DNA plus ligated adaptors is phosphorylated at the 5’-termini and ligated into the vector previously cut with BamHI.

2008年3月14日出版的《science》以“桥”为题，撰文纪念吴瑞教授。

吴瑞创建了中美生物化学联合招生项目（CUSBEA），1982年至1989年间，该项目共招收了400余位顶尖的中国学生来美学习研究生课程。 十年“文化大革命”后，中国出现了严重的人才断层现象。1978年，邓小平提出，为实现四个现代化、振兴中华，国家要大批派遣留学生出国深造，但在当时，落实这项指示存在很多困难。首先因为长期封闭，对西方发达国家的大学和研究机构缺乏了解，不知道往哪里派人；其次，也不知道西方国家的学术机构是否愿意接收中国学生。1981年初，偶然而又十分幸运地，吴瑞得知美国哥伦比亚大学教授李政道启动了中美联合招考物理研究生项目(CUSPEA)，这个项目帮助中国物理学专业大学生得以到美国攻读博士学位。他立即与李政道联系，探询启动类似项目、帮助生物学学生到美国学习的可能性。李政道很欣赏这个想法，并与中国高层官员联络，最终促成了中美生物化学联合招生项目(CUSBEA)的诞生。 吴瑞创建了中美生物化学联合招生项目（CUSBEA），1982年至1989年间，该项目共招收了400余位顶尖的中国学生来美学习研究生课程。 http://www.hudong.com/wiki/%E5%90%B4%E7%91%9E 科学网专题：深切缅怀吴瑞教授http://www.sciencenet.cn/news/sub.aspx?id=114

6.3 joining PCR products PCR扩增后的产物往往需要克隆到载体中，传统的PCR产物与载体的连接方法：在PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过程本身也相当的费时费力。 PCR产物的连接方法： Fill in the ends with Klenow（Klenow酶处理PCR产物将其补平，但平末端连接效率低） Remove extended bases with pfu DNA polymerase (高保真的pfu酶参与PCR反应，产物为平末端，但连接效率低) 采用T载体连接PCR产物（TA克隆法）：效率高，但在随后的亚克隆中不能定向克隆

Summary cccDNA、质粒拷贝数（Plasmid copy number）、三种构型的电泳、克隆/表达载体的概念、多克隆位点（Polylinker or multiple cloning sites，MCS）、 pBR322和插入失活筛选原理、pUC18和蓝白斑筛选原理（blue/white screening）（背景知识：乳糖操纵子的调控）、 -肽、-肽互补、T载体(T vector)、TA克隆（TA cloning）、 Ti质粒（Ti plasmid）、T－DNA、边界序列（border sequence）、穿梭载体(shuttle vector)、报告基因、筛选标记基因、GFP、GUS基因 这个网站收录了大量图谱： http://www.embl-hamburg.de/~geerlof/webPP/vectordb/bact_vectors/table.html Vectorpedia： 输入质粒骨架，直接查询，非常方便; http://www.addgene.org/pgvec1?f=v&cmd=listvecinfo

λ噬菌体的生活周期(life cycle)、λ噬菌体基因组的结构特征、λ噬菌体的包装过程、cos位点(cos site)、cosmid克隆载体的结构特点、cosmid克隆载体的优点、BAC、YAC、包涵体、引物（primer）、连杆（linker）、衔接头（adapter） 主要掌握的三种： λ噬菌体载体(λ vector)、 cosmid、 YAC（yeast artificial chromosome,酵母人工染色体载体） λ噬菌体载体与cosmid克隆载体的克隆容量？用柯斯质粒进行克隆实验的基本过程？用于克隆大片段DNA的载体有哪些？特殊用途载体？ 粘性末端(Cohesive terminus)、平末端(Blunt or flush end)的连接方法？ 掌握载体图谱的阅读，如T载体（pMD18-T）、植物表达载体pCAMBIA1300图谱